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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR退火温度如何设置
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liuy.04b

木虫 (小有名气)

[交流] PCR退火温度如何设置

在英俊合成的引物给了两个Tm：Tm（1M Na＋）和Tm（50m
M Na+），用哪个设计PCR反应的退火温度呀？
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1楼 2008-08-12 09:42:02
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xyklmu

至尊木虫 (知名作家)

虫眼看世界
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
引物合成报告单上写的Tm做个参考吧，我们在设计引物的时候，自己也可以用dnastar等软件计算一下，这条引物的Tm，两条引物只要Tm相差不是很大就可以的，我自己用手工设计引物，根据GC含量的高低确定pcr的退火温度都很成功，很少做不出来的。
不过要做实时定量PCR的话，还是要小心一些，他们有自己的一套严格的程序，一般的pcr不必这么过多地依赖软件。
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位卑未敢忘忧国。
7楼2008-08-13 19:01:05
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liuy.04b

木虫 (小有名气)
★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复，欢迎常来
以前我在生工合成的给一个有钠的一个没钠的Tm，我们用那个没钠的设计PCR退火温度，英俊的怎么设计呀？
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2楼2008-08-12 09:50:35
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复，欢迎常来
一开始用软件设计引物的时候，那个软件应该直接给出Tm了吧
然后一般把Tm减去3~5度就是退火温度了
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3楼2008-08-12 11:43:14
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xyklmu

至尊木虫 (知名作家)

虫眼看世界
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):楼主还有问题，你再看看。
我是不喜欢用软件来确定pcr的退火温度的，设计引物也经常是用手工，然后用软件最后做个比对就可以的。软件做出来的东西太死板，不知道根据具体的情况做点变化，前后移移位置之类的，以及避开一下难以扩增个的比如CCCC等。根据自己的待扩增片段的GC含量的高低，差不多56度或者58度就可以了，再根据扩增的结果适当做个调整。软件设计好了的引物到时候不见得扩增的顺利。
个人经验，呵呵。
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位卑未敢忘忧国。
4楼2008-08-13 00:45:37
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