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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 关于western blot的问题一大堆，求给位帮忙解答下之2（补充）
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moyunzhi

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于western blot的问题一大堆，求给位帮忙解答下之2（补充） 已有1人参与

发完第一个帖子，就又想到了一大堆的问题。再补刀一下。望大牛们的解答！
1.在SDS-PAGE电泳时， 分离胶的 浓度与分离的蛋白质大小的关系是怎么样的？另外，我如果分离一个225KD的蛋白，用8%的分离胶，另外我还需要检测一个35KD的蛋白，会不会影响很大？
2.为什么浓缩胶基本上都是4%的？这是经验所得？还是有一定原理？
3.公司卖的MARKER，可以自己做吗？为什么marker上有的蛋白可以显出颜色？（我猜测公司是将不同大小的蛋白分开提纯的，对其中一部分蛋白用染料结合。最后混匀出售？不知道有没有道理？）
4.蛋白的上样量是不是根据蛋白的浓度确定的？一般蛋白的浓度需要在多少可以显出适当的颜色？（或者说其浓度要视蛋白的抗原表位的多上也就是一抗对此的效价多少来单独确定？）
就是这些了。小弟还在大二，跟着老师做实验，可以老师每天都很忙，一问问题，老师就说自己去查。可是度娘不太靠谱，搜出来的都不是我想问的。简直是浪费我时间。这些问题又没有人提问过，少有人知道。实验室里的其他伙伴更是一问三不知。做这个实验心太累了（从暑假开始一直在做，每天就这样单调的重复着，一点希望的影子都看不到，我觉得自己已经很有耐心了吧？）。没有人知道。照着步骤做（因为这还是预实验，很多条件都还在摸索中，有种盲人摸象的感觉），又常常出现问题。每一次失败，都会很沮丧。
小弟又不知道该怎样去分析问题。从来没人教过，老师总是匆匆出现问几个问题，变一个条件又接着做，我简直无语到底。查资料又该如何开始呢?真希望有一位大神来指点下小弟。小弟实在困惑啊！
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1楼 2015-07-27 20:39:04
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moyunzhi

铜虫 (小有名气)
哎，就没有大牛肯帮小弟一把吗？自顶！
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2楼2015-07-28 22:03:47
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奋进的女孩

金虫 (小有名气)
1蛋白分子量越大，所用的胶的浓度会越小，这样胶上的孔径相对也大些，2一般用4%的胶应该能检测出我们经常跑的蛋白，但是浓度你也可以改的吧，不是有那种专门配胶的表格，各种浓度的胶都有，
3问题不大懂，哈哈
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3楼2015-07-29 11:13:14
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1510050322

银虫 (初入文坛)
回复4：蛋白质的上样量其实根本上是根据蛋白质的浓度来决定的，因为当时我们做的蛋白是真核蛋白，必须要求跑出来的条带中的内参含量是一样的，所以是根据蛋白浓度来上样的，其他的我就不知道了。
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4楼2015-07-29 21:41:26
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huiting410

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
大二能问出这么多问题是好事，首先1,8%可以，只要前沿指示剂不跑出去35kd的就跑不了。2，这个浓度浓缩效果最好，你知道浓缩的过程伴随SDS包被蛋白的过程，这个浓度最适宜。3， 有颜色是预染的marker。4，蛋白浓度一般10-40ug per lane，根据你细胞本身表达量的差异自己定量。5，不要无语，这种才最锻炼人，加油吧
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5楼2015-07-30 04:18:37
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moyunzhi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 奋进的女孩 at 2015-07-29 11:13:14
1蛋白分子量越大，所用的胶的浓度会越小，这样胶上的孔径相对也大些，2一般用4%的胶应该能检测出我们经常跑的蛋白，但是浓度你也可以改的吧，不是有那种专门配胶的表格，各种浓度的胶都有，
3问题不大懂，哈哈

感谢！3的问题就是说 ，MARKER公司是怎么做出来的，而且marker 跑出的条带是由颜色的，而且越贵的 颜色越多。 那这些颜色是预先单独对蛋白加上去的吗？
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6楼2015-08-01 22:07:54
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moyunzhi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 1510050322 at 2015-07-29 21:41:26
回复4：蛋白质的上样量其实根本上是根据蛋白质的浓度来决定的，因为当时我们做的蛋白是真核蛋白，必须要求跑出来的条带中的内参含量是一样的，所以是根据蛋白浓度来上样的，其他的我就不知道了。

恩。你们也是测吸光度来测浓度的吗？
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7楼2015-08-01 22:09:02
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moyunzhi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by huiting410 at 2015-07-30 04:18:37
大二能问出这么多问题是好事，首先1,8%可以，只要前沿指示剂不跑出去35kd的就跑不了。2，这个浓度浓缩效果最好，你知道浓缩的过程伴随SDS包被蛋白的过程，这个浓度最适宜。3， 有颜色是预染的marker。4，蛋白浓度一 ...

哦。明白了。感谢！我已经怀疑是蛋白浓度的问题了。我是按照试剂盒的说明书来提蛋白的。感觉并不适合我最后做WB。现在老师回北京去了。我的实验也停了。也只有等开学再继续了。谢谢鼓励！做了这么久也想发发恼骚。嘿嘿。
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8楼2015-08-01 22:13:53
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