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duyang1217

铁虫 (小有名气)

[求助] 请教聚合蛋白解离的方法已有1人参与

与pet32a重组表达蛋白，分子量约42-44KD，但是PAGE胶显示100-130KD之间诱导相对于为诱导有条差异明显的带，怀疑是目的蛋白聚合，但是用his-tag抗体未显色。我想试试使聚合蛋白解离的方法看看是否可以将此100-130KD的蛋白解离成单体，所以想请教大家聚合蛋白解离的方法，谢谢！
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用心 耐心 细心的做科研
1楼2015-07-17 17:11:53
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
拆分蛋白质多聚体为单体或者多亚基的蛋白质拆分为单个亚基的试验方法可以参考亲和层析的试验方法： （1）改变 pH 值或离子强度：比如可以使用 NaCl 梯度拆解，主要是用于静电作用引起的相互作用的蛋白质多聚体，改变 pH 值可以跟缓冲溶液的组成加入相应 的酸或者碱； （2）如果蛋白质多聚体主要为疏水相互作用，而且改变 pH 值的结果不够有效， 则需要用激烈的条件，比如加入聚乙二醇（最多到 60%，要分梯度加入）或二 甲基亚砜（dimethylsulfoxide）（一般最多到到 10%，要分梯度加入）以降低 水溶液的极性 （3）可以考虑加入去垢剂(表面活性剂)，它们是具有亲水基又具有疏水基 的物质，能够在低于临界胶束浓度（Critical Micelle Concentration ，简称： CMC）时有效结合于蛋白质的疏水区域，因此一般具有乳化、分散、和增溶作用， 可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型，中性去垢剂在蛋白提取 钟应用 的较多。 一般考虑使用的是：中性去垢剂或生物表面活性剂。 中性去垢剂 又称非离子表面活性剂，对蛋白质的变性作用影响较少，宜于蛋白 质或酶提取之用。一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类，如 PEG200；多元醇类表 面活性剂，如 山梨醇、司 盘类和吐温类；聚氧乙烯脂肪醇醚，如苄泽类、平平加类；聚氧乙烯烷基苯酚醚，如 Igepal CO、乳化剂 OP、Triton、Pluronic(用 作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌。中性去垢剂作用后可通过 Sephadex LH-50 柱除去；也可直接上 DEAE-Sephadex 柱层析分离目的蛋白，不必先除去去垢剂。 也可以用天然表面活性剂 又称为生物表面活性剂，包括种类较为广泛，如 各种树胶（阿拉伯胶、杏胶、桃胶、果胶）、明胶、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、 琼 脂、海藻酸钠、酪蛋白、胆甾醇、胆 酸类、多糖类（如环糊精）等。 具体用法可以参考有关试剂使用说明。浓度尽量低一些为好，浓度不能超过临界 胶束浓度（Critical Micelle Concentration ，简称：CMC）。 临界胶束浓度 cmc 的含义如下： 在水中的表面活性剂低浓度时呈分子状态， 并且三三两两地把亲油基团靠拢而分 散在水中， 当浓度逐渐增大一定程度时， 许多表面活性剂分子立刻结合成大基团， 形成“胶束”表面活性剂在水中形胶束所需的最低浓度称为临街胶束浓度，即 CMC. 意义：CMC 可作为表面活性剂表面活性的一种度量，CMC 越小，表明这种活性剂 形成胶束所需的浓度越低，达到表面饱和吸附的浓度越低。因而改变表面性质从 而起到润湿，乳化，增溶，起泡等作用所需的浓度也越低。此外，临界胶束浓度 也是表面活性剂溶液性质发生显著变化的一个分水岭，CMC 值对表面活性剂的研究 有着及其重要的参考价值的数据。
临界胶束浓度测定方法很多，用不同方法验证即可 （1）表面张力法
http://www.anatrace.com/tech_tips/TechBul_105.pdf
（2）电导率法 方法＆原理 http://151.fosu.edu.cn/hxsy/wuli ... daofajiaosu%20z.htm
http://u.edu.cn/UpLoadFile/20080119080151.doc
（3）紫外吸收分光光谱
http://www.ilib.cn/A-hxxb200624009.html
（4）.芘荧光探针光谱法
http://www.ilib.cn/A-shjsyyy200701012.html 其中芘荧光探针光谱法可信度较高
（5）Critical Micelle Concentration by Conductance and Raman
http://ed.augie.edu/~awaspaas/pchem/labs/cmc/cmc.html （4）也可以采用高浓度的（到 3mol/L）的离子解离盐（比如 KCN 或 KI）或中低 浓 度的变性剂（低于 4mol/L）的尿素或盐酸胍，都是分梯度加入。 总之，只要能拆解开多聚体即可，尽量少或不要变性，拆解后可用分子筛层析方法分开各个亚基或者单体。
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2楼2015-07-17 21:28:06
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duyang1217

铁虫 (小有名气)
谢谢专家！
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3楼2017-12-04 09:39:55
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