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平端连接后的检测
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最近需要对一个质粒的进行双酶切后补平然后自连。 双酶切、补平、连接、转化，每一步都做得很顺利，但是当挑选转化子进行检测的时候，发现提出的质粒大小不一，不过还好都在预期的位置，可是当我用原来进行双酶切的酶对补平自连的质粒再一次双酶切的时候，发现居然还是可以切开，对此很是不解。 分析一下可能原因， 1)双酶切步骤中有质粒未被切开，从而影响了下面的操作，即最后转化长出的转化子是未被切开质粒转化的结果； 可是我同时做了直接用酶切质粒转化的对照试验，并没有转化子长出。 2)补平的时候所用的T4 DNA 聚合酶不仅只将突出的3’端切平，而且更进一步随机向后切了一段下来。 个人认为原因2比较现实，因为这正好检测时质粒大小不一的结果比较符合。不过对于为什么补平自连的质粒还能被双酶切时使用的酶切开，我还是难以理解。 希望各位虫友能够帮忙解答，谢谢！ [ Last edited by 350784478 on 2009-7-16 at 20:29 ] |
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