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helenfang

铜虫 (小有名气)

[交流] 紧急求助:我这样的RAPD-PCR结果能用吗

请问下:我做RAPD所用的模板DNA不是用同一种方法提出来的,所以浓度相差蛮多的,这边测得的OD听说不准,所以虽然测了也没参照,而只是不同的方法挑了一个样品的模板DNA 用不同浓度做PCR,就选能P出来的浓度,其他菌就照着这个浓度做下去了,现在PCR都做完了,发现(其实之前就发现了)貌似有的时候有些模板P不出东西,其实我觉得一般应该是能P出东西来的,因为是用随机引物P的,而且亮度啊什么相差挺大的。现在想想之前是应该将DNA浓度调到差不多的再接着做下去的,但是现在已经来不及了,马上就面临毕业了,我们导师也说我P的还好的,但是我自己觉得不行,想请问下做过RAPD的或者懂的朋友,我这样的情况,那些电泳图还能用吗,能说明问题吗
非常感谢了!
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

印象中,RAPD其中有一个分析项目,就是要比较同一位置上条带的亮度差异
所以之前最好做好模板的定量,否则数据出来,说服力自然就……
测OD确实很难完全测准
但是同一批测的话,那个系统误差应该会向一边偏,如果你是做组间的相对比较的话,问题不是太大
测之前最好先开机预热30min
RAPD的重现性本来就不高的
所以有时候确实会P不出来,因而只能用统计学的角度去分析问题
建议最好是同一批样品同一批定量同一批PCR,这样出来的话,就具有比较高的可比性了
2楼2008-07-29 19:18:11
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helenfang

铜虫 (小有名气)

谢谢楼上,要比较亮度的吗,这个不知道耶
我主要担心的是由于没有定量模板,模板量有差异而导致有些样品P不出来,如果说只是亮度差异倒无所谓,反正做0-1矩阵的时候无所谓亮暗的了,我只要作出聚类图和遗传相似度表就好了
模板稀释了很多倍的,也许稀释之后可能相差就没那么大了,嘿嘿,如果真是那样就阿弥陀佛了
3楼2008-07-29 21:48:17
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

有点不大记得了~~~不过如果只是0、1的那种的话应该无所谓
不过担心的就是,有时候是因为模板量太少而导致某条带消失
比如某些基因(序列)只是单拷贝的(或者唯一的),刚好其中一条带就是这个基因(片段),那么就有点危险,但是只要模板量不是太少,那应该没问题
ug级别的应该就没问题了
数百ng就很危险了
4楼2008-07-29 22:21:07
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helenfang

铜虫 (小有名气)

恩,你说的很有道理,谢谢啦
5楼2008-07-30 18:34:59
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

不客气,多多交流~~~
6楼2008-07-30 22:00:35
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