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Cryo-poor plasma 900 L를 DEAE-sephadex A-50과 교반하여 흡착시킨 후 0.2 M NaCl이 포함된 Na-citrate 완충용액 (10 mM, pH 7.0)으로 세척 후 0.5 M NaCl이 포함된 Na-citrate 완충용액 (10 mM, pH 7.0)으로 혈액응고 제9인자를 용출 하였다. 이 정제액 60 L를 Na-citrate 완충용액(10 mM, pH 7.0)으로 투석, 농축하여-70°C에 보관하였다. Solvent/detei성ent를 이용한 화학적 바이러스 불활화 : 동결된 정제액을 융해한 후 단백질 농도를 15 mg/mL로 조 정하였다. 단백질 농도 조정 액 65.4 L의 온도를 25±0.5°C 로 보정한 후 Tween 80과 tri-(n-butyl) phosphate (TNBP)가 각 각 1%와 0.3%가 되게 첨가한 후，25±0.5°C로 8시간 동안 교반하면서 바이러스 불활화 공정을 수행하였다 DiBAErtoyopeari 6S0M anion-exchange column chromat(벙ra{diy : 바이러스 불활화 후액을 0.12 M NaCl이 포함된 Na-citrate 완충 용액 (10 mM, pH 7.0)으로 미리 평형을 시킨 DEAE-toyopearl 650M column (45 x 20cm)에 흡착시켰다. 그리고, 0.15 M NaCl이 포함된 Na-citrate 완층용액 (10 mM, pH 7.0)으로 1 차 세척한 후 0.1 M NaCl이 포함된 Na-citrate 완충용액 (10 mM, pH 7.0)으로 2차 세척을 하였다. 그 다음 0.3 M NaCl이 포함된 Na-citrate 완충용액 (10 mM, pH 7.0)으로 혈액응고 제9인자 활성 분획 16.3 L를 용출하였다. Heparin-sepharose 6FF affinity column chromatography : DEAE-toyopearl 650M 컬럼 용출액의 NaCl 농도를 0.2±0.05 M로 조정 투 Na-citrate 완중용액 (20 mM, pH 7.4)으로 평형 을 시킨 heparin-sepharose 6FF column (30 x 18cm)에 흡착 시켰다. Na-citrate 완충용액 (20 mM, pH 7.4)으로 1차 세척 후 0.15 M NaCl이 포함된 Na-citrate 완충용액 (20 mM, pH 7.4)으로 2차 세척하였다. 그 다음 L-arginine (1 g/L)과 0.3 M NaCl이 포함된 Na-citrate 완충용액 (20 mM, pH 7.4)으 로 혈액응고 제9인자 활성분액 27.5 L를 용출하였다. 용출 액의 pH를 1 M HC1 을 사용하여 4.1±0.02로 조정하였다. |
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