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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » SDS-PAGE条带完全不清晰，求助！
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by 我是传奇456 at 2015-06-12 12:26:11
5X的loading buffer，上样量大概20微左右，煮了5min，冰上5min，又煮了5min.这个上样量感觉也不多啊，看来要重新配个SDS上样buffer试一下？...

用些新鲜的SDS，按照1克蛋白质1.4克SDS配置，SDS的量大一些。
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11楼2015-06-12 14:25:08
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向光生长

禁虫 (知名作家)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
12楼2015-06-12 14:47:02
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 我是传奇456 at 2015-06-12 12:25:15
5X的loading buffer，上样量大概20微左右，煮了5min，冰上5min，又煮了5min....

1.煮沸后是否经过高速离心？比如12000rpm 10分钟？
2.虽然很多朋友针对LZ的问题提出了可能的原因，很多原因确实会导致条带的堆积与弥散，虽然点样量确实存在过大的问题，但是从带型上看，我还是倾向于LZ的PAGE问题出自你的样品本身。我猜测一下LZ的样品应该是多聚氨基酸类（比如聚谷氨酸）或者其衍生物吧，如果确实是此类样品，我认为LZ的PAGE出现此类带型是完全正常的。减小点样量就可以了，无需做其他优化，此图就可以反映真实情况~
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大家相互帮助哈
13楼2015-06-13 01:27:40
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我是传奇456

金虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-06-13 01:27:40
1.煮沸后是否经过高速离心？比如12000rpm 10分钟？
2.虽然很多朋友针对LZ的问题提出了可能的原因，很多原因确实会导致条带的堆积与弥散，虽然点样量确实存在过大的问题，但是从带型上看，我还是倾向于LZ的PAGE问题 ...

1.上样前离心了10min
2. 样品是菌株BL21的蛋白表达系统，后来全部采用康为世纪的商品化上样缓冲液，也会出现这种问题，样品处理是采用取1ml菌液离心后弃上清，用40微升dd水溶沉淀，然后加入10微升5X上样，煮沸等等。
另外采用了一组植物蛋白提取样品作一个对照，但是仍然会出现之前的地毯带情况。
请问这是否可能和电泳缓冲液有关？

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14楼2015-06-29 09:56:20
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 我是传奇456 at 2015-06-29 09:56:20
1.上样前离心了10min
2. 样品是菌株BL21的蛋白表达系统，后来全部采用康为世纪的商品化上样缓冲液，也会出现这种问题，样品处理是采用取1ml菌液离心后弃上清，用40微升dd水溶沉淀，然后加入10微升5X上样，煮沸等等 ...

1.只要你的marker跑的正常，条带数目和带型可以就完全能够排除和跑电泳的时候相关的一些因素，你的电泳缓冲液没有问题，只是分离胶的浓度大一些，你的marker有几条还在上沿。
2.LZ你为什么只跑个全细胞的呢，既然是大肠表达的产物为什么不先超声破碎一下跑个胞内蛋白看看呢？而且你上样的样品体系这么小，只用40ul溶解1ml菌液的菌体，不清楚你的菌体OD多少，照你跑的这个样子肯定菌体太多，loading buffer加的不足导致的胶孔堵塞。你用于点样的样品应该会比较黏吧。稀释到100ul或者200ul+相应的loading buffer再跑跑看。你的问题应该在样品预处理这一块。
3.至于你的植物蛋白提取样品，不太清楚你样品的预处理是怎么做的，建议同样稀释处理。
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大家相互帮助哈
15楼2015-06-29 13:51:14
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我是传奇456

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-06-29 13:51:14
1.只要你的marker跑的正常，条带数目和带型可以就完全能够排除和跑电泳的时候相关的一些因素，你的电泳缓冲液没有问题，只是分离胶的浓度大一些，你的marker有几条还在上沿。
2.LZ你为什么只跑个全细胞的呢，既然 ...

OK，谢谢！

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16楼2015-06-29 14:25:35
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