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厌氧菌落的分离【有效期至2008年9月1号】
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| 因为要做厌氧菌落的纯化分离，在查阅文献时看到有“矿物油密封-平板稀释法”，可以划出厌氧单菌落，所以请问这种方法的具体操作是怎样的？或谁知道有其他的方法能够分离出厌氧菌落的，也请介绍一下，谢谢！ |
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微生物接种在合适的培养基上后，必须提供合适的生长条件才能生长。由于不同的微生物需要的条件不完全相同，因此就有不同的培养方法。 (1)需氧培养。对于好氧的微生物，必须在有氧的环境中培养。在实验研究中，液体或固体培养基经接种后，保温培养在有氧的条件下，因为培养基在试管内或其他容器内总是有空气接触。为了加速繁殖的速度，或进行大量的液体培养时，就必须采用通气搅拌或振荡方法来充分供氧。但在通气培养时所供给的空气必须是净化的无菌空气。 (2)厌氧培养。培养厌氧微生物时，必须除去培养基中的氧气或使氧化还原电势降低，并在培养过程中一直能保持与外界氧隔绝，这样才能促使厌氧微生物的生长。在培养基中保持无氧环境的方法很多。 ①用物理法去除氧和隔绝氧的方法。厌氧罐法这是一种采用物理除氧的特制设备的培养方法。只要抽取罐内空气使之成真空，即为厌氧环境。也可把菌种接种在固体或半固体培养基的深部；还可将菌种接种在液体培养基中后，在液面封盖无菌矿物油。 ②用化学除氧的方法。在放置培养物的密闭容器中，用焦性没食子酸与碱性溶液(氢氧化钠、碳酸钠等)混合，使之发生反应，大量吸收氧，造成厌氧环境，进行厌氧性微生物培养的方法。也可在容器中利用黄磷和氧发生燃烧以除氧；还可在容器中放置亚硫酸氢钠和碳酸钠，使其混合发生反应而吸收氧。 ③用生物法除氧的方法。加组织的培养基培养法即在液体培养基内加入新鲜的肝、肾、心、脑、肉等组织作为还原物质，以吸取培养基中的游离氧，新鲜的动物或植物组织具有呼吸作用可以消耗氧。常用的有肝片肉汤、肝片肝汤、肉渣汤(疱肉)等培养基。如在这些培养基表面加一层灭菌的液体石蜡以隔绝的空气进入，则效果更佳。在厌氧微生物的培养时，与需氧微生物共同培养，使氧消耗，以利厌氧微生物生长更好。 在进行厌氧微生物的培养时，有时可采用两种不同方法结合起来，使厌氧微生物培养效果更为理想。 (3)二氧化碳培养法。有些微生物如布氏杆菌等，需在含10％二氧化碳的环境中才能良好生长。常用的培养方法有蜡烛缸法、硫酸—碳酸钠法等。 在培养过程中，所采用的温度和时间等，应根据不同微生物的生长特点来确定。 5.1.1. 蒸馏水悬浮法 这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。好气性细菌和酵母等可用此法保存。 5.1.2. 斜面传代保藏 斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。 5.1.3. 矿物油中浸没保藏 此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验，因为某些菌株如酵母、霉菌、细菌等能利用石蜡为碳源，还有些菌株对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏，为了预防不测，一般保藏菌株 2~3年也应做一次存活试验。 5.1.4. 干燥-载体保藏 此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。是将菌种接种于适当的载体上，如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。以沙土保藏用得较多，制备方法为：将河砂经24目过筛后用10%~20%盐酸浸泡3~4 h，以除去其中所含的有机物，用水漂洗至中性，烘干，然后装入高度约1cm的河沙于小试管中，121℃间歇灭菌3次。用无菌吸管将孢子悬液滴入砂粒小管中，经真空干燥8 h，于常温或低温下保藏均可，保存期为1~10年。土壤法以土壤代替砂粒，不需酸洗，经风干、粉碎，然后同法过筛、灭菌即可。一般细菌芽孢常用砂管保藏，霉菌的孢子多用麸皮管保藏。 5.1.5. 冷冻保藏 冷冻保藏是指将菌种于-20℃以下的温度保藏， 冷冻保藏为微生物菌种保藏非常有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了保藏的结果更加令人满意，通常在培养物中加入一定的冷冻保护剂；同时还要认真掌握好冷冻速度和解冻速度。冷冻保藏的缺点是培养物运输较困难。 普通冷冻保藏技术(-20℃)：将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，于冰箱的冷藏室中贮藏，或于温度范围在-5~20℃的普通冰箱中保存。或者将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分别接到试管或指管内，严格密封后，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力 1~2年。应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。 超低温冷冻保藏技术：要求长期保藏的微生物菌种，一般都应在-60℃以下的超低温冷藏柜中进行保藏。超低温冷冻保藏的一般方法是：先离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞，再用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞，然后加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜冷冻保护剂，混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1~2℃/ min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。 液氮冷冻保藏技术：近年来，大量有特殊意义和特征的高等动、植物细胞能够在液氮中长期保藏，并发现在液氮中保藏的菌种的存活率远比其他保藏方法高且回复突变的发生率极低。液氮保藏巳成为工业微生物菌种保藏的最好方法。具体方法是：把细胞悬浮于一定的分散剂中或是把在琼脂培养基上培养好的菌种直接进行液体冷冻，然后移至液氮(-196℃)或其蒸汽相中(-l56℃)保藏。进行液氮冷冻保藏时应严格控制致冷速度。液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤是先制备冷冻保藏菌种的细胞悬液，分装0.5~1ml入玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口。然后以1.2℃／min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)。待细胞冻结后，将致冷速度降为1℃／min，直到温度达到-50℃，将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相 (-156℃)中保存。如果无控速冷冻机，则一般可用如下方法代替：将安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油一般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。 5.1.6. 真空冻干保藏 真空冷冻干燥的基本方法是先将菌种培养到最大稳定期后，一般培养放线菌和丝状真菌约需7~10天，培养细菌约需24~28小时，培养酵母约需3天。然后混悬于含有保护剂的溶液中，保护剂常选用脱脂乳、蔗糖、动物血清、谷氨酸钠等，菌液浓度为109~1019个/ml，取0.1~0.2ml菌悬液置于安瓿管中冷冻，再于减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华至1%~5%，使培养物干燥。最后将管口熔封，保存在常温下或冰箱中。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一，大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。但操作过程复杂，并要求一定的设备条件。 5.1.7. 寄主保藏 适用于一些难于用常规方法保藏的动植物病原菌和病毒。 5.1.8. 基因工程菌的保藏 随着基因工程的不断发展，越来越多的基因工程菌需要得到合理的保藏，由于它们的载体质粒等所携带的外源DNA片段的遗传性状不太稳定、且其外源质粒复制子很容易丢失。另外，对于宿主细胞质粒基因通常为生长非必需，一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。而由质粒编码的抗生素抗性在富集含此类质粒的细胞群体时极为有用。当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。由此看来基因工程菌最好应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。例如，质粒pBR322。它除了能将外源DNA 输入E．coli细胞外，还赋予E．coli细胞Ampr和Tetr。如果在培养基中加入Amp和Tet，则培养时可选择出含pBR322质粒的细胞。 5.1.9. 菌种保藏机构 1979年7月，我国成立了中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM),委托中国科学院负责全国菌种保藏管理业务,并确定了与普通、农业、工业、医学、抗生素和兽医等微生物学有关的六个菌种保藏管理中心。各保藏管理中心从事应用微生物各学科的微生物菌种的收集、保藏、管理、供应和交流。以便更好地利用微生物资源为我国的经济建设、科学研究和教育事业服务。 |
2楼2008-07-24 11:38:53