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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教关于构建质粒载体的问题
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足下客

木虫 (正式写手)

[交流] 请教关于构建质粒载体的问题

我要构建一个新的穿梭质粒。扩增出我需要的目的基因片段后，再插入到pUC18的多克隆位点中。请问插入外源基因片段时，有正反方向之分吗？反向插入和正向插入有什么区别呢？
PS：我不是做的表达载体，外源基因片段是一个内源性质粒中编码质粒稳定蛋白和复制起始蛋白的基因
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1楼 2008-07-23 14:27:44
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足下客

木虫 (正式写手)
如果正向插入会不会导致多克隆位点上游的lac启动子发挥作用，然后使蛋白过量表达，影响菌的生长啊？
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3楼2008-07-23 18:01:17
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pph0259

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
给你一个比较正确的回答：
你的外源基因片段是一个内源性质粒中编码质粒稳定蛋白和复制起始蛋白的基因，请问这个基因是自带启动子吗？如果是的话，正反插入一般没有太大的影响，但有一定的影响，就是你担心的那个问题。所以最好反向插入，避开lac启动子。
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4楼2008-07-23 19:25:15
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lvpeng_ujs

新虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
如果你是用的双酶切连进PUC载体的的话就不用考虑方向问题。
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5楼2008-07-23 20:11:24
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足下客

木虫 (正式写手)
谢谢楼上的解答。我的基因不是自带启动子的
不过为什么用双酶切就不用考虑方向问题呀？
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6楼2008-07-24 21:35:27
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