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铜虫 (著名写手)

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[交流] 高GC含量基因异源表达的问题

各位好！
我从一株嗜热细菌中找到一个基因，其编码一个水解酶，按照常规思路，把它克隆到表达载体中（PET-32a），诱导表达该水解酶，但只能测到微弱的酶活性，启动子用的是PET载体自身的启动子，这是很强的启动子，按道理应该可以超量表达，看到清楚的蛋白胶条带才对啊？为什么表达量这么低呢？感受态细胞用的是普通的JM109,也考虑过大肠杆菌密码子的偏好性问题，对序列分析后发现该基因含有的很多密码子都不是大肠杆菌的偏好密码子，且分散在序列的各处，不集中。如果要将这些密码子全部替换为大肠杆菌的偏好密码子，估计工作量会很大，基因长1.4kbp,我初步尝试了一下，用的方法是反向PCR ，考虑引物价格，每次设计两条引物，50-60bp 左右，两条引物的5‘端分别含有要突变区域的一部分，然后以重组质粒为模板去扩，扩增产物割胶回收后浓缩，平末端磷酸化，连接自身环化，电转JM109，挑阳性克隆提质测序，同时测看酶活有没有提高，用这个方法每次只能改20几个氨基酸密码子，就是每次都能突变成功，最起码也要重复做20多次。请教各位高手，除了这种办法进行突变，还有没有别的方法可以更快更方便的替换基因中的这些稀有密码子？要突变质粒上的单个碱基，我在木虫上看到过相关的帖子，但如果要替换掉质粒上的特定片段区域，比如一个长度超过100bp的序列，将其换成我想要的序列，除用反向PCR的方法外，还有没有其他的办法，我不是太明白，相信一定有高手可以提供相关的宝贵经验。
我还有个怀疑，如果引物设计的过长，是不是会不纯，做反向PCR，突变区域就位于两条引物的5‘末端，那么引物不纯是否会导致得到不同的突变质粒，这些质粒分别含有长短不一的突变序列？

另外，该基因的GC含量特别的高，70%左右，重组质粒突变后提取出来测序，经常在基因序列下游某处测序中断，怀疑该处存在复杂的DNA的二级结构，测了几次序，中断位置都很接近，没有办法，在中断位置处选了大概100bp的序列，设计了引物，准备将该段替换掉，替换的原则是氨基酸序列不变，全部换成大肠杆菌最偏好的密码子，同时预测了一下突变后序列的二级结构，基本没有发夹结构了，但现在奇怪的是，一条引物退火温度为56度，另一条为58度，我用pyrobest高保真酶去做PCR，模板用量10ng，退火温度我试了56和60度，都没有扩增出任何条带，不知道是何原因？

高GC含量的异源基因，特别是来自极端嗜热菌的，想要在中温宿主，比如大肠杆菌中进行过量表达，除密码子偏好外，还需要注意哪些关键问题？有没有哪位达人已经成功的进行了表达？我实在不知道还有什么行之有效的方法可以提高蛋白的表达量。很奇怪，我想不可能只有改密码子偏好这一种方法可以用吧？但似乎没有更有效的了。希望能提供宝贵的经验！谢谢！！！
[search]高GC含量[/search]

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