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银虫 (初入文坛)

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[求助] 酵母中为什么双敲菌比单敲菌长势要好呢？已有1人参与

本人敲除了两个与线粒体功能有关的基因，在非发酵性培养基上表现出生长缺陷，但是这两个基因双敲之后在非发酵性培养基上比单敲菌长得好，这是为什么，费解…………

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1楼 2015-05-31 22:52:19

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引用回帖:

6楼: Originally posted by 潇潇杨雨125 at 2015-06-02 01:13:13
你好，能把你的具体转化步骤发给我吗？不胜感激～～谢谢
...

1、10×LiAc：称量10.2 g 乙酸锂，用无水乙酸调pH至4.9，最后定容至100 ml。
2、10×TE（pH 7.5）：称量1.21 g Tris Base，0.372 g EDTA，最后定容至100 ml。
3、50% PEG：准确称量50 g PEG定容至100 ml，注意，PEG吸水膨胀。
4、酵母转化液I（现配现用）：10×LiAc 100 μl，10×TE 100 μl，ddH2O 800 μl。
5、酵母转化液II（现配现用）：10×LiAc 70 μl，10×TE 70 μl，50% PEG 560 μl。
具体方法你参考一下，我研究的模式生物是粟酒裂殖酵母：
1、将yHL6381单菌落接种于5 ml的YES培养基中，于30 ℃，220 rpm恒温摇床中培养过夜。
2、将过夜培养的菌液稀释5-10倍测OD600，然后转接至新鲜的YES培养基中，使其起始OD600为0.2，于30 ℃，220 rpm恒温摇床中继续培养直到OD600达到0.5左右。
3、在室温条件下，4000 rpm离心4 min，丢掉上清，细胞用1 ml无菌超纯水重悬，洗涤细胞6000 rpm离心2 min，去掉上清。
4、用800 μl的酵母转化液I将细胞重悬，6000 rpm离心2 min洗涤细胞，去掉上清。
5、用100 μl的酵母转化液II重悬细胞，加入DNA产物15 μl，Herry Sperm DNA 5 μl充分混匀后将混合液加入酵母转化液II中。
6、将混合液转入42 ℃水浴中温育30 min。6000 rpm离心 2 min，收集细胞用80 μl的无菌水重悬，并涂布于合适的选择性培养基中。
7、32 ℃恒温培养箱中培养5天之后，挑取长出的单菌落进行划线，32 ℃培养3天。之后挑取新鲜的菌落接种于YES培养基中，过夜培养之后提取基因组。