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银虫 (初入文坛)

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专业: 蛋白质组学

[交流] 详解你不了解的泛素化，有图有实例哦！！！！已有5人参与

蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用，它使蛋白质的结构更为复杂，功能更为完善，调节更为精细，作用更为转移。常见的蛋白质翻译后修饰过程有泛素化、磷酸化、乙酰化、糖基化等，同时还有一些特殊的翻译后修饰如甲基化、巴豆酰化、戊二酰化，丙二酰化，琥珀酰化等在生物过程中起到重要的作用。

而今天小编想和大家共享的是关于泛素化研究，一直以来，人们都忽视了蛋白质水解酶参与细胞功能的调控，泛素和与其相关的蛋白水解酶的发现，给整个科学界带来了**性的影响。泛素由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞内，故名泛素。泛素化是可逆的，依赖ATP并且通过泛素激活酶E1，泛素结合酶E2，泛素连接酶E3一系列催化反应所致。

具体过程为首先在ATP(红色所示)供能的情况下酶E1(蛋白质编号1r4n)粘附在泛素分子尾部(淡黄色所示)的Cys残基上(绿色所示,注意在这个结构中,Cys突变为Ala)激活泛素,接着,E1将激活的泛素分子转移到E2酶上(蛋白质编号1fxt),随后,E2酶和一些种类不同的E3酶共同识别靶蛋白,对其进行泛素化修饰。根据E3与靶蛋白的相对比例可以将靶蛋白单泛素化修饰和多聚泛素化修饰。E3酶(蛋白质编号1ldk和1fqv)的外形就像一个夹子,靶蛋白连接在中间的空隙内(星号所示)。酶的左侧结构域决定靶蛋白的特异性识别,右侧结构域定位E2酶以转移泛素分子。

泛素化可以生产出单泛素化或多泛素化蛋白质。后者在当7个赖氨酸残基的泛素与另一个泛素的甘氨酸C端连接形成。这种泛素分子链接在生物过程中起到重要的作用。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶识别并降解，这是细胞内短寿命蛋白质和一些异常蛋白降解的普遍途径。泛素化及类泛素化蛋白在细胞分裂，自噬，DNA修复，免疫应答，细胞消亡等方面同样起到关键作用。与消化道内进行的蛋白质水解不同，从泛素与蛋白的结合到将蛋白水解成小的肽段，整个水解过程需要能量参与。人们开始意识到泛素-蛋白酶系统是一个对于真核细胞非常重要的调节系统。

1、泛素化实验方案
（1）利用可以纯化泛素化底物的抗体（PTM-1101）富集并利用高通量质谱检测，该方案具有高灵敏度及高特异性。

（2）His-taggedubiquitin:该方案具有高特异性，但在有些生物样本中面临挑战，如动物组织及临床样本。因为泛素化发生在个体分子中不同位点不同水平上，往往会导致富集出的蛋白在酶解后产生大量非修饰肽段影响结果鉴定。

2、泛素化研究挑战和解决方案
1）挑战
运用质谱检测泛素化会发生很多假阳性结果，所以在实验中需要非常小心的验证。虽然泛素化质量偏移114.043 Da在质谱中可以精确检测出，但是还有其他的一些情况也会导致114Da的质量偏移结果干扰鉴定结果。具体状况如下。
（1）天冬酰胺但单同位素残基质量分数为114.043Da；
（2）在蛋白酶解过程中普遍运用碘乙酰胺（IAM）对肽段进行碘乙酰化反应，而此时半胱氨酸及赖氨酸（有时）上会发生碘乙酰化修饰增加57.021Da分子量；
（3）其他氨基酸影响，亮氨酸与异亮氨酸单同位素质量分数为113.084Da以及他们m+1同位素质量分数为114 Da。

2）解决方案
（1）改变烷基化试剂或者调整烷基化孵化温度；
（2）设置更高的质量准确度阈值及手动或软件验证的单一同位素质量。

3、实例分享
Scientific Reports: SAHA在蛋白质组、泛素化组及乙酰化组中的神奇关联

来自安徽省立医院，安徽医科大学及杭州景杰生物科技有限公司的研究人员在SAHA（SuberoylanilideHydroxamic Acid）治疗非小细胞肺癌（A549Cell Line)机制研究中取得重大突破，发现经过SAHA刺激治疗后的非小细胞肺癌A549细胞系在蛋白质组，泛素化修饰组及乙酰化修饰组之间有着密切的crosstalk。本研究内容发表在2015年3月31日的ScientificReports杂志上。

组蛋白去乙酰化酶（HDACs）作为重要的癌症诊断标志物被人们熟知，而SAHA作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂对CTCL（cutaneousT-cell lymphomas）癌症诊疗试剂首个被FDA认证的。该药对非小细胞肺癌,乳房癌以及子宫癌都有较好的疗效。在之前的研究中已经证实SAHA对癌细胞的蛋白质组及乙酰化修饰组有着明显的影响，而是否还有别的修饰类型对其产生影响，修饰之间有无新的crosstalk还待深入研究。

在本研究中研究人员基于SILAC（stableisotope labeling by amino acids）标记，PTM-Biolabs生产的抗体富集及高分辨率液相质谱定量技术对SAHA处理前后的A549细胞进行蛋白质组，泛素化组及乙酰化组进行分析。其中蛋白质组共鉴定到4302个蛋白质，其中2968个蛋白被定量。在生物学分析中上调蛋白大多集中在线粒体及内质网中，而下调的蛋白则集中在细胞核，染色质，核糖体，剪接体混合物及转录抑制因子混合物中，这说明SAHA的治疗抑制了细胞转录。进一步通过该策略研究泛素化组，科学家们鉴定到613个蛋白质，1067个泛素化位点，其中586个蛋白质1012个泛素化位点被定量。而大多数泛素化修饰的蛋白都集中在细胞膜上，这说明泛素化在细胞膜上扮演了重要的角色。乙酰化组鉴定到551个蛋白质，1124个乙酰化位点，其中542个蛋白质1099个乙酰化位点被定量。同时在组蛋白层面鉴定到91个乙酰化位点，这是现在全球最大的SAHA处理A549细胞的乙酰化组数据库。而这些上调的乙酰化蛋白和转录有着很大的关联。

通过对蛋白表达水平分析科学家们发现蛋白质组与泛素化组呈现负相关，这也与泛素化导致蛋白质降解功能是相关的。而在对泛素化组与乙酰化组关联性分析上科学家们发现在SAHA治疗后呈现正相关性。非组蛋白的乙酰化和泛素化的转录因子可以通过转录组影响蛋白质组水平，而组蛋白的乙酰化可能通过表观遗传学影响蛋白质组学水平。

该研究首次在SAHA治疗非小细胞肺癌中发现了泛素化修饰，并深度分析了该修饰生物学作用，让蛋白质翻译后修饰与蛋白质表达水平的相关性研究为今后该领域的研究起到了指导的作用。更为重要的是蛋白质组，泛素化组及乙酰化组crosstalk的研究对于扩展我们对SAHA治疗肺小细胞癌的治疗有了更为深刻的了解，为后期对该领域的机制研究提供了方向。

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubm ... d+Acetylome+in+Non-

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附件 1 : 2015.03--Scientific_reports--Suberoylanilide_Hydroxamic_Acid_Treatment_Reveals_Crosstalks_among_Proteome,_Ubiquitylome_and_Acetylome_in_Non-Small_Cell_Lung_Cancer_A549_Cell_Line.pdf

2015-05-28 16:15:40, 2.62 M