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wwfifa

铜虫 (小有名气)

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[交流] 有关双酶切

请高手赐教，宝生物公司所出内切酶EcoRI和NotI能否双酶切啊，酶切效果怎样啊，还有就是由这两个酶切的产物，定向克隆到pET28a表达，其阅读框是否会发生变化啊，谢谢各位高手了。

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1楼 2008-07-13 18:51:07

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xyklmu

至尊木虫 (知名作家)

虫眼看世界

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专业: 发育生物学

这两个酶都使用宝生物公司的H反应缓冲液，应该是可以进行双酶切的。
要设立两个单酶切的对照，如果单酶切切得很完全，应该认为双酶切也是完全的，还有两个酶识别位点之间有34个碱基的片段释放出来，从大小上也可以判断是否双酶切了。
阅读框的问题，就看你在克隆你的基因的时候如何设计带有酶切位点的引物了，连接不会改变你的阅读框的，关键是在最初设计引物的时候就得考虑好阅读框的问题。
还有一点需要提醒一下，EcoRI这个酶是有Star activity的，一般不可以切太久或者加太多的酶，否则会发生识别位点的错误。

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位卑未敢忘忧国。

2楼2008-07-14 01:29:40

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