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蝶舞623

银虫 (小有名气)

[交流] 基因工程酶切问题

各位老师好!请问在构建基因表达载体时,一种DNA限制性内切酶切和两种DNA限制性内切酶切,各自有什么优缺点呢?在实际的实验过程中,采取的哪一种方法?
能否提供点有关构建基因表达载体过程中,用双酶法的一些资料给我学习学习!谢谢!
[search]酶切[/search]
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pph0259

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
蝶舞623(金币+3,VIP+0):谢谢您!
两种酶切,同时进行,快速简便,如果这两种酶可以在相同的缓冲中进行,就比单酶切好。反之,就不得不选择单酶切依次切,每次都要换缓冲液,有一定的DNA损失。你可以看你买的酶的生产公司的酶切说明书,里面相当清楚详细。不是送货时附的那张纸,是公司的大本说明书!
2楼2008-07-09 23:07:33
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343666605

银虫 (小有名气)

★ ★ ★
蝶舞623(金币+3,VIP+0):谢谢您!
如果一个限制性内切酶可以切开的话,最好用单酶,因为很少有两种酶的活性在同一个buffer里面具有100%的酶切活性。如果必须用两种限制性内切酶,通过对载体和要得到的片段的筛选,你可能能得到几个可用的酶切位点,从这几种酶里面选择有公用buffer的,并且酶切活性都要在75%以上的;如果实在找不到,就需要酶切两次,先用第一个酶切,回收后,再用第二个酶切,但是这种方法,确实容易流失东西,不过你可以通过加大酶切量来弥补损失。比如,一下你配制了酶切体系是1.5ml,你可以把它分成3个管进行酶切。

希望能对你有帮助。
3楼2008-07-10 08:29:49
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