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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因工程酶切问题
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蝶舞623

银虫 (小有名气)

[交流] 基因工程酶切问题

各位老师好！请问在构建基因表达载体时，一种DNA限制性内切酶切和两种DNA限制性内切酶切，各自有什么优缺点呢？在实际的实验过程中，采取的哪一种方法？
能否提供点有关构建基因表达载体过程中，用双酶法的一些资料给我学习学习！谢谢！
[search]酶切[/search]
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1楼 2008-07-09 19:19:36
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pph0259

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
蝶舞623(金币+3,VIP+0):谢谢您！
两种酶切，同时进行，快速简便，如果这两种酶可以在相同的缓冲中进行，就比单酶切好。反之，就不得不选择单酶切依次切，每次都要换缓冲液，有一定的DNA损失。你可以看你买的酶的生产公司的酶切说明书，里面相当清楚详细。不是送货时附的那张纸，是公司的大本说明书！
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2楼2008-07-09 23:07:33
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343666605

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
蝶舞623(金币+3,VIP+0):谢谢您！
如果一个限制性内切酶可以切开的话，最好用单酶，因为很少有两种酶的活性在同一个buffer里面具有100％的酶切活性。如果必须用两种限制性内切酶，通过对载体和要得到的片段的筛选，你可能能得到几个可用的酶切位点，从这几种酶里面选择有公用buffer的，并且酶切活性都要在75％以上的；如果实在找不到，就需要酶切两次，先用第一个酶切，回收后，再用第二个酶切，但是这种方法，确实容易流失东西，不过你可以通过加大酶切量来弥补损失。比如，一下你配制了酶切体系是1.5ml,你可以把它分成3个管进行酶切。

希望能对你有帮助。
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3楼2008-07-10 08:29:49
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