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静水深流106

铁虫 (初入文坛)

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[交流] 细胞培养用液的配制与消毒

1.  器材与试剂：
  干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素.纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。
  具体步骤：
1.1  水的制备：
  细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.
1.2  PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：
1.2.1  溶解定容：将药品（NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4·H2O1.56g，KH2PO40.2g）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。
1.2.2 移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
1.3  胰蛋白酶溶液的配制与消毒：
  胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
1.3.1  称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。
1.3.2  用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
1.4  青、链霉素溶液的配制于消毒
1.4.1  所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。
1.4.2  具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。
1.4.3使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位＝1微克
1.5  RPMI1640的制备与消毒：
1.5.1  溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml,使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。
1.5.2  安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
1.5.3  抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
1.5.4  分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。
1.5.5  使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。
1.6  血清的灭活：
  细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭活30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。
1.7  HEPES溶液：
  HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanicacid）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。
   1mol/LHEPE缓冲液配制方法如下：
  准确称取HEPTS238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4℃保存。
  注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20mmol/L。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。
1.8  谷氨酰胺：
  合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。
  一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。
1.9  肝素溶液的配制：
  含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为℃。使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。
1.10  型胶原酶：
  0.1％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。
1.11  明胶溶液：
  因为明胶难于过滤，所以配制0.1％明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）—即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是0.1%的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml小瓶中，4℃保存。

1.12  其他培养用液的配制：
20ug/ml内皮生长因子，
  注意事项：
1.12.1 配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。
1.12.2  安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。
1.12.3  配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。

2.细胞传代培养（消化法）

　　具体操作：
2.1  传代前准备：

2.1.1  预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
2.1.2  .用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
21.3  正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
2.1.4  点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
2.1.5  准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。
2.1.6  取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
2.1.7  从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
2.1.8  打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
2.2  胰蛋白酶消化；
2.2.1  加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
2.2.2显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
2.2.3  吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。
2.3  吹打分散细胞：
2.3.1  吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
2.3.2  吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。
2.3.3  平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6～8分钟。
2.3.4  弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
2.4  分装稀释细胞：
2.4.1  分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
2.4.2  显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。
2.5  继续培养：
  用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。
  传代细胞培养注意事项：
2.5.1  严格的无菌操作
2.5.2  适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
  附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二钠）消化液配方：
  EDTA0.20g，NaCl8.00g，KCl0.20g，KH2PO40.02g，葡萄糖2.00g，0.5％酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。
2.6  细胞的复苏
  细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
  具体操作
2.6.1  实验前准备：
2.6.1.1  将水浴锅预热至37℃
2.6.1.2  用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
2.6.1.3  在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2.6.2  取出冻存管：
2.6.2.1  根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.6 .2.2  从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.6.3  迅速解冻：
2.6.3.1  迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
2.6.3.2  约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
2.6.4  平衡离心：
  用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min离心3min
2.6.5  制备细胞悬液：
2.6.5.1  吸弃上清液。
2.6.5.2  向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。
2.6.6  细胞计数：
  细胞浓度以5×105/ml为宜。
2.6.7  培养细胞
  将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。
  初学者易犯错误：
1水浴锅未预热或者未预热到37℃。
2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。
4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。
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