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三磷酸腺苷铁杆木虫 (职业作家)
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[交流]
重亚硫酸盐修饰检测DNA甲基化，没辙了……
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我用的是重亚硫酸盐修饰后测序法来研究DNA的甲基化情况 将基因组DNA提取出来后（QIAGEN的试剂盒） 测浓度，然后还是用QIAGEN的修饰试剂盒，将1.5ug（于20ul的溶剂）的DNA放进去修饰 修饰完之后，测吸光度，发现剩下0.4ug（20ul溶剂）左右的DNA 但是跑电泳完全没有条带 我还以为是DNA量实在太少所以电泳看不出来 于是拿去PCR 但是35个循环下来，也不见条带 引物设计应该是没问题的，已经考虑到修饰后未甲基化的C变成了U 之前引物是忘记考虑这个因素，拿修饰前的基因组DNA去P，有条带，新设计的引物就考虑了这个因素，但修饰前的基因组DNA还是能P出来。 但修饰后的，无论什么引物都P不出来。 感觉太奇怪 已经在这上头花了一个月的时间，完全不知道哪里出错了。 各位大虾帮帮忙出主意，谢谢！ |
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brassica227
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6楼2008-07-07 09:51:16
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三磷酸腺苷
铁杆木虫 (职业作家)
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嗯，谢谢，难怪许多文献都没有提到修饰后去跑电泳 关于引物，其实那些软件也都是将非CG序列的C转换为T，然后按照这个原则来设计引物的。 我用原始序列贴到prime primer 5去设计，然后手动修改了这些区域的碱基。 但其实手动修改的地方不是很多，差不多就在5'有2~3个位点需要改。（我想这么少的错配即使不改也不会有什么问题吧。然后事实证明，无论改还是不改，都能够将修饰前的DNA给扩出来） 然后用这种引物去P没有修饰的DNA也有条带 昨晚又查了些资料，发现有人先用降落PCR做了20个降落循环，然后再用40个循环继续扩增。算起来就60个循环了呢……汗 我打算用这种方法试试 不过得另外去买好一点的酶了，普通Taq酶这么多循环肯定结果都乱七八糟了~ |
4楼2008-07-07 09:11:43