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jiangxizhongyao

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专业: 药物化学

[交流] 冰冻切片和HE染色已有17人参与

近几天做肝脏的病理形态学检查，要做病理切片，找了相关资料，正好有空，就

发了这贴共看！
该贴附件主要是说明冰冻切片的方法（还是个改良的）和HE染色的主要步骤。

以下是学习简介，没空别看。
我是一个学药化的，老师的课题确是中药，于是搞搞提取分离，当我做到还没到位时，就被赶来做药理，于是盲目找资料，幸好碰到住一起的同学做药理，给予了指点。但是，我做的药理还涉及病理，所以又请教相关的同学－－－－－－－－－－－为什么不请教老师：因为以前学药化没想到认识这不相干的人（希望虫民们多认识人，别抱我这心态）------所以于是痛苦，可是问题还是来了，暑假同学们很多都回家了。还得继续想办法，就象同学说的，还得DIY！！！

所以如果有高手，还请指点一下。

正文：
冰冻切片HE染色步骤

一、操作方法及步骤：

①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。
②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。
③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。

二、冰冻切片时的注意事项：

①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。

③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。

④组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。

⑤当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。

⑥用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。

三、冰冻切片的快速染色方法：

① 切片固定30秒－1分钟。
② 水洗。
③ 染苏木素3－5分钟。
④ 分化。
⑤ 于碱水中返蓝20秒。
⑥ 伊红染色10－20秒。
⑦ 脱水，透明，中性树胶封固。
冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述。

常规方法：

（1）冰冻切片固定                   10～30 s
（2）稍水洗                         1～2 s
（3）苏木精液染色（60℃）             30～60 s
（4）流水洗去苏木精液                5～10 s
（5）1%盐酸乙醇                      1～3 s
（6）稍水洗                         1～2 s
（7）促蓝液返蓝                      5～10 s
（8）流水冲洗                      15～30 s
（9）0.5%曙红液染色                30～60 s
（10）蒸馏水稍洗                      1～2 s
（11）80%乙醇                         1～2 s
（12）95%乙醇                         1～2 s
（13）无水乙醇                         1～2 s
（14）石炭酸二甲苯                   2～3 s
（15）二甲苯（Ⅰ）                   2～3 s
（16）二甲苯（Ⅱ）                   2～3 s
（17）中性树胶封固。

注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇，染色结果为：细胞核蓝色、胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。

封片切片染色后封片常用中性树胶，酸性的树胶可使胞核褪色，如树胶放置时间过长，因氧化而变酸。中性树胶可用二甲苯稀释。树胶过浓，封片时容易导致气泡；过稀，封片时易使胶外溢，影响美观，也会出现由于二甲苯挥发后缺胶的现象。

在整个染色过程中不让切片干涸：切片完全干涸，会使组织收缩和出现裂痕即出现所谓“龟裂”现象。也会使部分细胞核透明不良，看起来像黑色的细胞核，即形成“黑核”。

冰冻切片制作方法改进探讨
中华首席医学网 2007年09月15日 05:59:39 Saturday
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作者：李建红石天峰
作者单位：长治医学院病理教研室（046000）长治卫校
《长治医学院学报》2007年8月22卷4期临床医学
【摘要】  目的：探讨制片效果比较理想的冰冻切片制作方法，以提高冰冻切片的质量。方法：择取新鲜活体组织，取材后直接冻结，经恒温式冰冻切片机切片，冰冻固定液固定，HE染色。剩余组织做石蜡切片对照。结果：质量较好，染色鲜艳，镜下组织结构细胞形态清晰，细胞核浆对比分明。结论：此方法简便快速，制片质量满意，可提高病理诊断的准确性。
【关键词】  冰冻切片；制作；冰晶
　　冰冻切片的方法是一种最省时最快速的制片方法，因此主要用于临床手术中的病理诊断。其原理是：冷冻使组织变硬以代替石蜡做浸蜡。将组织固定在标本托上短时间内冻好进行切片。术中确诊病变性质，决定手术范围，因此做出高质量的冷冻切片至关重要。这就要求每个病理技术人员不仅要有高度的责任心，还要有熟练的技术，在最短时间内制出高质量的切片。我科在工作中，经过反复试验和不断改进，摸索出一种制片效果比较理想的冰冻切片制作法，在术中病理诊断取得满意的效果，现介绍如下。
　　
　　1  材料与方法
　　1.1  材料

　　2006年我科完成的冰冻切片140例其中涉及到的组织标本有乳腺70例，卵巢55例，甲状腺15例。采用德国莱卡恒温式冷冻切片机。
　　1.2  方法

　　择取新鲜活体组织取材后直接冻结、切片、即投入固定液（配制方法：40%福尔马林15 mL，95%乙醇80 mL，冰乙酸5 mL）中，固定1 min～2 min，入苏木素染核1 min～2 min，水洗后，1%盐酸乙醇分化数秒，水洗后，0.1%氨水返蓝，水洗后，入1%水溶性伊红10 s左右，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封固。
　　2  结果

　　使用该方法所制冰冻切片速度明显提高，切片质量较好，染色鲜艳，镜下组织结构，细胞形态清晰，细胞核，细胞浆色彩鲜艳对比分明，术后诊断符合率达96%以上。
　　3  讨论

　　病理技术是病理学诊断不可分割的一部分，制片质量的好坏很大程度上影响病理医生做出正确的病理诊断。因此，保证和提高制片质量是每个病理技术员的责任。为了保证制片质量，减少差错，防范责任事故，避免医疗纠纷，有必要加强对病理技术进行科学规范管理和制片的控制。在冰冻切片方面我科主要从以下环节上加强质控。
　　3.1  组织取材大小

　　组织块大小适宜，理想取材大小为1.5 cm×1.5 cm，厚2 mm。组织过大，切片时阻力过大，易产生皱折，刀痕，组织易崩碎，增加制片难度，影响诊断。如需在同一标本托上放大小两块组织时，应尽量冻成一个平面，与刀锋平齐，以防切片不完整，发生漏诊。若送检组织过小，请预先速冻一冷台面，再行包埋，利于制片。
　　3.2  冷冻时间

　　速冻时间过长，切片呈碎屑或条痕状，其处理方法是：切出完整平面后用戴乳胶手套的拇指按压回温，直到切片完整为止，反之，时间过短，切片呈粥糜状或切不下来，则需继续冷冻。
　　3.3  切片

　　切片时用力均匀，厚度约4 μm～5 μm，特殊要求时可达3 μm，切好的组织在干净的玻片上粘附时可顺着一个方向稍微用力轻轻一带，可避免组织摊片过程中皱折，切好后立即放入提前配制好的冰冻切片固定液中及时固定1 min～2 min［１］。
　　3.4  染色

　　切片后做快速HE染色,苏木素染色过程需加热进行,一般1 min～2 min即可。这样做出来的快速切片镜下观结构完整、平坦、无皱折。细胞核与细胞质染色色泽鲜艳,对比清晰,细胞无肿胀,无收缩,近似常规石蜡切片,封片时注意无气泡及无溢液,切片整洁,标签清楚端正,根据需要可切出半张玻璃片大小,厚薄均匀,一层细胞的组织切片［２］。
　　3.5  冰晶的形成致使无法及时准确地为临床提供病理诊断依据。我们知道，生物体是由细胞构成的，一般情况下，细胞中水分约占80%～90%，水在各种组织中含量最多，其解决方法为：①在不影响病理诊断的前提下，标本取材尽量小一些，组织厚度勿超过4 mm，这样有利于组织的快速冻结，将组织块快速移到冷冻头上骤冷以缩短冷冻时间,减少冰晶现象出现,有效防止冰晶挤压周围组织，改变甚至破坏组织原来的形态结构［３］。②临床科室若术中需要冰冻，应通知病理科，以便提前开机做好准备，这样可避免由于缓慢冷冻所产生的冰晶。因为冷却速度愈快，过冷温度越低，所形成的晶核数量越多，晶体来不及生长就被冻结，从而失去了形成较大冰晶的机会。③需要术中进行快速病理诊断的活检组织，最好用一次性塑料或乳胶手套盛放，切忌用纱布包裹组织，以免纱布上的线毛粘在组织上，不利于制片，且易损伤刀刃。④临床医师送检标本尽量避开水源不要用生理盐水浸泡或用湿纱布包裹组织，由于液体浸泡后，组织内水分会增加，易造成冷冻后组织内冰晶形成增多。组织送检取材时，如遇含水量高的标本时，应尽量用干纱布吸干水分后再行冷冻，避免由于冰晶形成出现诊断上的失误。

　　对于冰冻切片的质量因素主要有以上几点，固然还存在某些其他方面的因素。如果能正确对待以上几方面的问题，冰冻切片的质量方可得到保证，且能制备出一张质量优秀的切片，为明确病理诊断提供较为便利的客观条件。
【参考文献】
  　　［１］骆新兰.冰冻切片常见问题探讨［Ｊ］.临床与实验病理学，1999,15(4):273.

　　［２］列增辉.病理染色技术［Ｊ］.北京:人民卫生出版社,2000：35.

　　［３］田玉旺,丁华野．一种减少冷冻切片组织内冰晶的处理方法［Ｊ］.临床与实验病理学杂志,2002,18(5):568.
[search]药理冰冻切片 HE 染色[/search]

[ Last edited by jiangxizhongyao on 2008-7-3 at 21:45 ]

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