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DNA突变库
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最近一直在构突变库就是构不出来 PCR产物加磷，再连接，取少量转化板上就是不长。 4.5k大小的片段（PS），在引物上设计突变位点。 回胶产物加磷体系如下 8ul (sample) +0.9 ul T4 buffer +0.7ul PNK----37℃，1h 之后 +0.4 T4 buffer +0.5 T4ligase + 1ul PNK————22℃ 2h 之后取少量转化（化学转化先试试看的） 可是试了好几次就是不长克隆或者就长几个，可是我要的量要成十几万个， 也换过一下体系 8ul (sample) +0.9 ul T4 buffer +0.7ul PNK----37℃，1h 之后 组分 平末端连接 线性载体DNA 20-100 ng 10X T4 DNA Ligase buffer 2 μl 50% PEG 4000 溶液* 2 μl T4 DNA Ligase 1 μl (5 u) 水，无核酸酶 (#R0581) 至 20 μl 取1ul转化就是不长克隆，感受态是JM109和MACHI，急死我了，帮帮忙各位。。。。 |
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