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huangsp001

新虫 (初入文坛)

[交流] 蛋白质表达 已有4人参与

最近做实验有点困惑。
研究海洋真核藻类的某一功能基因，实验室采用的是原核表达系统。基因是合成的，合成时针对表达系统做了密码子优化。但是表达起来就是有障碍，诱导表达温度高，产生包涵体蛋白；诱导温度低，可溶性蛋白产量很低。
表达系统：pET28b载体，Rosetta（DE3）诱导表达菌株
诱导条件：OD=0.5，IPTG 0.1、0.5mM，28℃、25℃、20℃、18℃、16℃，20-24h

求教各位大神，如何优实验条件，才能得到大量的、有活性、可溶蛋白？
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1楼 2015-04-03 11:13:52
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你需要的蛋白是一定要上清么？如果不需要的话，做一下包涵体复性试试。一般来说，蛋白表达纯化的实验条件优化主要就是密码子优化和诱导条件的优化，建议试着更换载体（如pET-32a）和培养基，如果原核实在做不出来，你可以改换真核表达系统。
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
2楼2015-04-08 10:26:51
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那年书生

木虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我觉得可能是你的IPTG浓度太低了，PET28b是t7lac类型启动子，一般iptg的浓度要在1.0mM，15-20度过夜，可以使可溶性蛋白产生最大值。
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当你苦逼的选择了这个专业，你便只能风雨兼程的苦逼走下去，做个不苦逼的苦逼……
3楼2015-05-18 11:12:01
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火拼一把

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问你的密码子是怎么优化的？
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莫管江湖多变幻，一心只把论文灌。
4楼2015-07-07 09:17:54
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木木清月月鸟

禁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
5楼2015-08-07 10:29:03
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