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求助，关于硝基还原酶的体外还原实验 已有1人参与
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求助，我设计的底物为硝基咪唑类化合物，硝基理论上在体内能够被硝基还原酶还原为氨基，现在想在体外模拟该实验。 参照文献的方法，操作很简单，配置一定浓度的底物，酶，NADH，放在一起37°C震荡，文献上20分钟就有反应，但是我一直没有做成功。 请问： 1.硝基还原酶和NADH是否容易变质，要现买现用？我的酶是配成容易冻在-20°C，大约有4,5个月，NADH没有配成溶液，-20°C。 2.NADH和NADPH该如何选择，效果是否一样。 3.由于体内的硝基还原酶在低氧的环境下才高表达，体外实验是否要控制一个低氧的环境? 还有其他什么要注意的事项吗？谢谢！ |
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pennchem
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
伪学术真酱油: 金币+15, ★有帮助 2015-03-18 18:32:06
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首先，必须要有一个标准实验，来验证你的酶是有活性的。 （天然材料分离的蛋白，或者商业化的蛋白，或发表文献中表达纯化的蛋白） 其次，天然底物可以被合成或者其它的底物替代 当然，反应的条件一定要让蛋白处于活性状态。 酶如果买了暂时不用，分装后低温保存，越低越好。 NADH和NADPH好像不能互相替代。 底物如果不稳定，最好也是分装后低温保存。 good luck 此外，你的酶活性中心是否为金属离子，能保持该离子反应中的价态保持一致吗？ 如果低氧条件下才能反应，那么应该有足够还原剂，把反应放在glove box里试试看？ |
2楼2015-03-13 19:56:33
liwenjuan189
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fanghongbao
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