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[交流]
做分枝杆菌感受态及转化的亲们进来交流下吧~
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首先给大家推荐一本分枝杆菌的书<Methods in Molecular Biology Vol 101 Mycobacteria Protocols> ，道客巴巴上有，很全面，是做分枝杆菌相关研究的必备宝书！！ 本人做结核杆菌感受态及转化有一年多时间了，大致步骤如下： 首先感受态制备：7H9+ADC 中培养3周。因为宝书中有提到37℃制备的感受态比传统的冰浴条件下制备的感受态转化效率更高，因此制备过程分为两组：1，冰浴的10%甘油，4℃洗涤三遍, 2，采用37℃的10%甘油，常温洗涤三遍。最后收集菌体-80℃保藏。 电转：4mm电转杯。400ul感受态。2ug质粒。冰浴十分钟。BIO-RAD电击：2.5kv，25uF,1000Ω，约21~23ms。冰浴十分钟。转入试管，加入5ml7H9，37℃180rpm24h。涂布于潮霉素（100ug/ml）抗性7H10+OADC平板。4~6wk后观察。 鉴定：本人转化的质粒分为不含EGFP的和含有EGFP的。前者就是挑取单克隆培养2周后菌液PCR鉴定，但板子上能长出的菌落很少，最后能扩增且PCR阳性的就更少。后者本人设想在平板就观察到荧光，再挑取含有荧光的单克隆培养，但实际情况是肉眼也观察不出来，在荧光显微镜在又有很多非特异绿色荧光，甚至连不含EGFP的板子上的菌落也能观察到  总之就是很难转化成功，是否转进去也不容易观察，并且好不容易转进去的传代次数多了还容易丢 各位亲们支支招啊 |
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