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nnfyw木虫 (著名写手)
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[交流]
大肠杆菌表达酶的平板筛选
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脂肪酶，淀粉酶，纤维素酶等酶基因，构建带信号肽活不带信号肽的原核表达质粒，转化大肠杆菌，经常看文献报道直接通过添加橄榄油、干酪素、CMC等直接筛选，平板上可以产生透明圈 ，我做过淀粉酶和脂肪酶，却是可以产生透明圈，但是大家都知道添加信号肽的表达质粒表达部位在大肠杆菌的周质空间，不加信号肽则细胞质中表达。不能分泌到细胞外，不能分泌到细胞外怎么能在平板上产生透明圈呢？ 请解释这一现象，发生的过程及文献支持。 |
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4楼2008-06-15 08:48:21
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lixiaoyi1981(金币+3,VIP+0):谢谢，一个回答一个金币，呵呵。
nnfyw(金币+50,VIP+0):3Q
lixiaoyi1981(金币+3,VIP+0):谢谢，一个回答一个金币，呵呵。
nnfyw(金币+50,VIP+0):3Q
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两个解答： 一是在周质空间中的很多酶可以渗透到细胞壁外。 另外，根据分泌系统的不同，有些分泌系统是可以直接分泌蛋白质到细胞壁外的。 参见：Expressing genes in different Escherichia coli compartments Current Opinion in Biotechnology Volume 11, Issue 5, 1 October 2000, Pages 450-454 二是，在平板上，细胞表达过程中，很多细胞是死亡了的（E.coli的代时好像是20分钟）。死亡的细胞有裂解的细胞内容物出现。所以在平板筛选中，其实不用分泌表达也同样可以得到活性筛选的效果。当然如果是分泌表达，由于周质空间中，蛋白质不容易被降解，那么筛选的效果更好。 三是，即使不用分泌型表达，也可以使用表达后破胞的方法使表达产物进入到培养基中，然后进行筛选。 |
2楼2008-06-14 10:41:28
nnfyw
木虫 (著名写手)
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3楼2008-06-14 15:14:40
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