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11楼2015-02-06 17:54:05

wuwenmei

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10楼: Originally posted by biofanie at 2015-02-05 12:48:25
用于蛋白质纯化，包含一个his tag, 因此可用nickle柱子纯化蛋白，是一个比较常用的载体，我经常用，好使。
其图谱和序列图见附件，作为你的参考，其中序列图上有详细的酶切位点图，可直接使用。

我现在也面临着这个问题，老板让我利用SUMO构建重组蛋白在原核生物中表达，我选用的是pET-3C载体，老板说这个载体不适合折叠蛋白表达，让我换一个，我觉得你给的pET-28a挺合适的，有没有的好的推荐的，PET-SUMO有用过吗？

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12楼2015-03-23 22:04:36

wuwenmei

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5楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-02-03 09:06:17
用处：pET是一种载体，可以将一段序列（目的基因）加到这个载体上，形成一个环状的质粒，然后将这个质粒转入到大肠杆菌体内进行表达，能很好的将目的基因表达出来。
公司：Novagen一直致力于研发pET系统，还有自 ...

我看懂你的解释，我想问下选择不同的载体对表达有影响吗？PET-SUMO有用过吗？由于第一次接触，是个小白，今天写实验方案选择的pET-3C,这个载体是从别人论文中看到的，而老板说不适合折叠表达的蛋白，弄的我都不知道选哪个载体。有没有好推荐的？谢谢你

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13楼2015-03-23 22:08:00

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13楼: Originally posted by wuwenmei at 2015-03-23 22:08:00
我看懂你的解释，我想问下选择不同的载体对表达有影响吗？PET-SUMO有用过吗？由于第一次接触，是个小白，今天写实验方案选择的pET-3C,这个载体是从别人论文中看到的，而老板说不适合折叠表达的蛋白，弄的我都不知道 ...

不同的载体当然对表达有影响啊。我们一般的如果是在原核中表达的话，pET24a 28a 30a 32a 43.1a 20d 都是常用的，因为做实验嘛，就是一个摸索的过程，所以每次做实验都是选择2-3种载体进行摸索，最终确定最佳的载体。pET -sumo没有用过，这个载体在原核表达中应该不热门吧

todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful

14楼2015-03-24 08:45:12

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14楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-03-24 08:45:12
不同的载体当然对表达有影响啊。我们一般的如果是在原核中表达的话，pET24a 28a 30a 32a 43.1a 20d 都是常用的，因为做实验嘛，就是一个摸索的过程，所以每次做实验都是选择2-3种载体进行摸索，最终确定最佳的载体 ...

哦，知道了，您刚刚说的几种载体，有那种是比较好用的。我也是想在原核生物中表达。

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15楼2015-03-24 10:08:06

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15楼: Originally posted by wuwenmei at 2015-03-24 10:08:06
哦，知道了，您刚刚说的几种载体，有那种是比较好用的。我也是想在原核生物中表达。
...

我刚刚说的，全部都好用，因为我们都经常用的，真的

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16楼2015-03-24 15:50:56

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16楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-03-24 15:50:56
我刚刚说的，全部都好用，因为我们都经常用的，真的...

我不是希望它好用，我喜欢它的实用性强，因为做研发，所以希望表达效率要高，不好意思哈，第一次接触，老板就是一句话自己查文献去，

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17楼2015-03-24 16:47:56

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17楼: Originally posted by wuwenmei at 2015-03-24 16:47:56
我不是希望它好用，我喜欢它的实用性强，因为做研发，所以希望表达效率要高，不好意思哈，第一次接触，老板就是一句话自己查文献去，...

我说的好用就是实用性强的意思啊，你表达不同的蛋白（当然前提是在原核中表达）想要确定最佳载体，你得尝试各种载体才能确定啊。
还有蛋白表达的表达率高低，载体的选择只是一方面的，有时候都得进行几十个条件的优化对比才能找到最佳组合呢，尤其是基因，你在表达之前就应该优化，不然基因本身与载体宿主菌就不相容的话，怎么选择载体怎么优化实验都不会成功，不是包涵体就是没活性，总之祝福你了
http://www.detaibio.com/gene-expression-optimization.html
对优化的内容介绍的挺详细，推荐给你看看

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18楼2015-03-24 17:13:54

wuwenmei

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18楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-03-24 17:13:54

我说的好用就是实用性强的意思啊，你表达不同的蛋白（当然前提是在原核中表达）想要确定最佳载体，你得尝试各种载体才能确定啊。
还有蛋白表达的表达率高低，载体的选择只是一方面的，有时候都得进行几十 ...

我的目的基因就是一段确定的序列，这个在这之前也可以进行改造吗？我不知道，不过你说的有道理，明天和老板说书哦，先拿两种载体摸索下，这样看文献找也不是问题，选两个载体都有相同的两个酶切位点，估计也便宜点，把我的目的序列连上SUMO直接重组在构建都载体上好了，不知道老板同不同意？

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19楼2015-03-24 19:42:03

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19楼: Originally posted by wuwenmei at 2015-03-24 19:42:03
我的目的基因就是一段确定的序列，这个在这之前也可以进行改造吗？我不知道，不过你说的有道理，明天和老板说书哦，先拿两种载体摸索下，这样看文献找也不是问题，选两个载体都有相同的两个酶切位点，估计也便宜点 ...

就我之前给你的那个网址上，上面有一段对基因合成之前的优化步骤，就是密码子优化的那一步。当然可以改造啊，而且表达出的蛋白不会变的，你可以仔细的看看

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20楼2015-03-25 08:36:18