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Sample TextSample TextSample Text Abstract A gene encoding the thermostable -amylase from hyperthermophilic archaeon Thermococcus hydrothermalis was cloned in Escherichia coli. In an effort to achieve the improved expression, fourDNAprimers (three reverse and one forward) were designed to yield three recombinant variants of -amylase. The additional aim of the re-cloning was to verify how the changes at the C-teminal end of the recombinant -amylase introduced by the pET vector and 6-His tag may affect the resulting specific activity of the variants. Biochemical characteristics of the recombinant -amylases, i.e. molecular weight, temperature optimum, and pH optimum, were confirmed to be the same as those of the original -amylase: 53.6 kDa, 85 ◦C, and 5.5, respectively. Concerning the specific activities, the addition of two residues succeeded by six histidines (LEHHHHHH) had in fact no influence, whereas the insertion of a longer peptide between the original -amylase C-terminus and the 6-His tag (DPNSSSVDKLAAALEHHHHHH) caused a substantial decrease (more than 40%) in comparison with the specific activity of the original protein. The recombinant -amylases were preliminary tested for their ability to hydrolyze 1% and 10% corn starch suspensions. Two types of starch were used: Meritena 100 (amylose starch) and Meritena 300 (amylopectin starch). Concerning the -amylase concentration sufficient to reach the industrial requirements, i.e. dextrose equivalent 6–12% in 3 h, one unit of enzyme activity at defined conditions per mg starch can be considered as optimal concentration with 10% starch suspension. It was found that even a simple and partial purification (boiling the enzyme supernatant for 5 min) is enough for improving the course of corn starch hydrolysis in order to accomplish the technological parameters in a reasonable time. |
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maorongwang
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摘要 一个基因编码耐热-淀粉酶从hyperthermophilic古thermococcus hydrothermalis被克隆在大肠杆菌中的表达。在努力实现改善的表达， fourdnaprimers （ 3扭转和一着）设计产量的3重组变种 -淀粉酶。额外的目的，重新克隆，以核实如何变化，在C - teminal年底重组-淀粉酶所提出的 宠物向量和6 -他的标记，可能会影响所产生的特定活动的变种。生化特性的重组-淀粉酶，即 分子量，温度适宜， pH值的优化，证实是相同的那些原-淀粉酶： 53.6 kDa的， 85 ◦ C ，以及 5.5 ，分别。有关具体活动，除了两个残留成功地由6 histidines （ lehhhhhh ）已在事实上没有任何影响力， 而插入一个较长的肽之间的原-淀粉酶C端和6 -他的标记（ dpnsssvdklaaalehhhhhh ）所造成的 大幅下降（ 40 ％以上）在比较具体的活动原来的蛋白质。重组-淀粉酶进行了初步 测试他们的能力，水解一％和10 ％的玉米淀粉的禁赛处罚。两种类型的淀粉被用来： meritena 100 （直链淀粉）和meritena 300 （支链淀粉的淀粉） 。关于-淀粉酶浓度足以达到工业要求，即葡萄糖，相当于6月12日％ 在3小时，一个单位的酶活性在界定的条件每毫克淀粉可被视为最佳浓度与10 ％的淀粉被停牌。它 被发现，即使一个简单的和部分纯化（沸腾酶上清液为5分钟）是不够的，提高的过程中玉米淀粉 在水解，以完成工艺参数在合理的时间。 |
2楼2008-06-11 21:58:42
flyrain363
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请楼主参考，其中关于酶活力的定义有点不太确定。
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在大肠杆菌中表达了hyperthermophilic archaeon Thermococcus hydrothermalis 编码的一个耐热-淀粉酶。为增加表达量，设计了4条DNA引物（三条反向引物和一条正向引物），用于表达不同的重组（突变）淀粉酶。目的是研究重组淀粉酶C末端在插入pET载体部分序列和6His后对其特异性的影响。重组淀粉酶的生化特性，如分子量，最适温度，最适pH和原始的（未突变）的淀粉酶一样：53.6 kDa, 85℃，5.5。对于特异性的研究则发现，在淀粉酶C末端和6His之间插入两个氨基酸(LEHHHHHH)对其特异性没有影响，但是两者之间插入较长片段(DPNSSSVDKLAAALEHHHHHH)则引起酶活性的大幅下降（降幅超过40%）。用1%和10%的谷类淀粉悬浮液作为底物，对重组的淀粉酶进行酶活测定。实验中使用了两种淀粉：meritena 100 （直链淀粉）和meritena 300 （支链淀粉）。为使其催化效率满足工业要求，即3小时后葡萄糖的浓度能达到6-12%，酶活力单位的定义为：在给定条件下催化每毫克淀粉的酶量被认为是10%淀粉悬浮液中最适酶浓度。研究发现，即使是很简单的粗纯化产物（细胞破碎上清煮沸5分钟），也能够满足在单位时间内催化淀粉水解的各项技术参数 [ Last edited by flyrain363 on 2008-6-12 at 19:27 ] |
3楼2008-06-12 19:26:06
