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[交流]
肌肉DNA提取不成功
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提取的是鱼肉里的DNA，用的是台湾旭基的试剂盒，严格按照试剂盒的操作程序。但是最后提取的溶液用紫外分光光度计在260nm处没有吸收，用双光束扫描，260nm处不出峰。为了分析原因，将提取过程中各步骤中的废液也做紫外分析，在260nm处都没有吸收，大家帮我分析下原因吧，是不是太笨了，拿试剂盒都提不出来。提取的程序大致为： 1、 组织溶解：剪下20mg组织到离心管中。用提供的micropestle管将组织研磨成粉。加入200ulGT缓冲液，继续研磨使样品均质化。 2、 裂解：加入20ul蛋白酶k，混合，振荡；60°孵育30min，孵育过程中每5min倒置一次；加入GB缓冲液，混合振荡5秒；70°孵育20min，直到裂解液澄清。孵育过程中，同样每5min摇晃一次。这个过程中，预热elution缓冲液，（200ul）70°，用于第5步。 如果孵育后有未溶解物质，13000离心2min，转移上清到新的离心管中 3、 DNA结合：在样品裂解液中加入200ul乙醇，迅速振荡混匀10秒，如果出现沉淀，吹打使其散开；将GD管放入collection管中；将所有混合物包括沉淀转移到GD管中。13000离心2min。扔掉滤过的液体，将GD管置于新的收集管中。 4、 冲洗：在GD管中加入400ulW1缓冲液。13000离心30s，扔掉滤过的液体，将GD管放回。加入600ul清洗液到GD管中。离心13000转30s。扔掉过滤液体，放回GD管。再次离心13000 3min，使柱子基质干燥。 5、 DNA洗脱：标准的溶液体积是100ul，如果样本的量比较少，减少溶液体积到30-50ul，以增加DNA浓度。如果需要的DNA产量比较高，就重复DNA的洗脱过程增加其回收率，总的洗脱溶剂使200ul。 转移干的GD柱到干净的1.5ml离心管，加入100ul的预热洗脱缓冲液到柱基质的中心。静置5min直到洗脱液被基质吸收。13000离心30s洗脱纯DNA 一点峰都不出，为什么？DNA去那里了，完全没有。 ps：蛋白酶消化过程中，样品完全融解，没有不溶的物质出现。所有步骤的废液作紫外分析。只有第一次的废液里在280nm（蛋白）处有峰。 |
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2楼2008-07-08 19:38:24
xyklmu
至尊木虫 (知名作家)
虫眼看世界
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- 专业: 发育生物学
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你的试剂盒不是专门提取肌肉DNA的吧？因为肌肉中蛋白的含量特别高，所以在蛋白酶消化这一步要特别注意。其实提取DNA这一步没有必要用试剂盒，除非是实验室富得实在不行的，呵呵。 我们在剪取小鼠的尾巴做genotyping的时候，我们用如下的裂解液： 100 mM Tris-HCl pH 8.5 5 mM EDTA 0.2% SDS 200 mM NaCl 100 ug/ml 以上溶液皆为最终使用浓度。 55度孵育过夜。 还有要注意肌肉的量，太多了肯定裂解不充分。 以后的步骤无非也就是先离心去除未裂解的肌肉，加等体积异丙醇沉淀DNA以及70%乙醇洗涤沉淀等常规的方法。 楼主不妨试试。 |
3楼2008-07-14 20:53:06
4楼2008-07-19 13:30:16