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xewangjie2004

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[交流] RNA抽提细节技巧小总结

对大部分实验人员来说，RNA抽提比基因组DNA抽提要困难得多。事实上，现有的RNA抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提RNA，比抽提基因组DNA更方便，成功率也更高。那为什么同样的方法用于组织RNA的抽提，总会碰到问题呢？
   组织RNA抽提失败的两大现象是：RNA 降解和组织内杂质的残留。关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提RNA不容易降解。现有的RNA抽提试剂，都含有快速抑制Rnase 的成分。在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的Rnase，所以RNA得以保持完整。也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其RNA不容易被降解；反过来讲，组织中的RNA之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。因此，假定有一种办法，在抑制RNA活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制Rnase活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的Rnase降解RNA的速度快。电动匀浆器效果较好，玻璃匀浆器效果较差，但总的来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象的。因此，如果抽提出现降解，原来用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原来用玻璃匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎100%能获得解决。影响后续实验的杂质残留问题，其原因比降解更多样，解决方法相应也不同。总之，如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象，则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进行优化。优化大可不必使用您的宝贵样品：可以从市场上购买一些鱼/鸡之类的小动物，取相应部分的材料用于RNA抽提，其它部分用于抽提蛋白质——嘴用来碾磨，肠胃用来抽提。
   究竟怎样才能确保RNA抽提的成功率呢？实验前选择合适的方法/试剂，这是最重要的一步。好的方法/试剂在确保成功的同时，操作方便，经济实用。当然，您的选择可能仍然有问题，这就需要能正确分析实验失败的原因，以便改进。

实验前方法/试剂的选择
0：抽提 RNA的目的
   RNA用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA文库构建要求RNA完整而无酶反应抑制物残留；Northern对RNA完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR对RNA完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。投入决定产出，每次都以获得最高纯度的RNA为目的，劳民伤财。
1：样品的收集/保存 – 影响降解的因素
   样品离开活体/或者原来的生长环境后，样品中的内源酶即会开始降解RNA，降解速度与内源酶含量及温度有关。传统上，只有两个办法可以彻底抑制内源酶活性：立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆；切成小块后立即投入液氮冷冻。这两个办法都要求操作快速。后者适合所有的样品，而前者只适合细胞及内源酶含量较低的并且较容易匀浆的组织。具体地讲，植物组织、肝脏、胸腺、胰腺、脾脏、脑、脂肪、肌肉组织等最好都先用液氮冷冻起来，再往下做。
2：样品的破碎及匀浆 – 影响降解和得率的因素
   样品的破碎是为了彻底匀浆，匀浆是为了使RNA彻底完整地释放出来。细胞无须破碎即可直接匀浆，组织需要破碎后才能匀浆，酵母菌和细菌需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。内源酶含量较低并且较容易匀浆的组织可以在裂解液中通过匀浆器一次完成破碎和匀浆过程；植物组织、肝脏、胸腺、胰腺、脾脏、脑、脂肪、肌肉组织等样品，它们不是内源酶含量高，就是不容易匀浆，所以必须将组织的破碎和匀浆分开操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的匀浆方法是使用电动匀浆器。使用液氮碾磨要特别注意一点：在整个碾磨过程中，样品不能融化，因为冷冻后内源酶更容易起作用。
3：裂解液的选择 – 影响操作方便程度，内源杂质残留的因素
   常用的裂解液几乎都能抑制 Rnase 活性，因此，选择裂解液的重点是要结合纯化方法一起考虑。只有一个例外：高内源酶含量的样品建议使用含苯酚的裂解液，以增加灭活内源酶的能力。
4：纯化方法的选择 – 影响内源杂质残留，抽提速度的因素
   对于干净的样品，如细胞，手边的几乎任何纯化方法都可以获得满意的结果。但对于许多其它样品，尤其是植物、肝脏、细菌等杂质含量很高的样品，选择合适的纯化方法是至关重要的。柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响RNA后续酶反应的杂质，但价格较贵；使用经济而经典的纯化方法，如LiCl沉淀等，也可以获得满意的结果，但操作时间长。

RNA 抽提的“三大纪律八项注意”
纪律一：杜绝外源酶的污染。
注意一：严格戴好口罩，手套。
注意二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。
注意三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。
纪律二：阻止内源酶的活性
注意四：选择合适的匀浆方法。
注意五：选择合适的裂解液。
注意六：控制好样品的起始量。
纪律三：明确自己的抽提目的
注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。
注意八：RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。

RNase 污染的10大来源
   1：手指头 – 手指头是外源酶的第一来源，所以必需戴手套并且频繁更换。另外，口罩也必需戴，因为呼吸也是一个重要的酶来源。戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。
   2：枪头，离心管，移液器  单纯的灭菌是不能灭活RNase的，所以枪头和离心管要用DEPC处理，即使是标明为DEPC处理过的。移液器最好是专用的，用前用75%的酒精棉球搽拭干净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。
   3：水/缓冲液  一定要确保无RNase污染。
   4：实验台面最起码要用 75% 的酒精棉球搽拭干净。
   5：内源 Rnase  所有组织均含内源酶，故组织用液氮速冻是降低降解的最好办法。液氮保存/碾磨方法的确不方便，但对有一些内源酶含量很高的组织，却是唯一的办法。
   6：RNA 样品  RNA抽提产物可能都会含痕量的RNase污染。
   7：质粒抽提质粒抽提往往用到RNase降解RNA，残留的RNase要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。
   8：RNA 保存  即使低温保存，痕量的RNase亦会导致RNA降解。长期保存RNA的最好办法是盐/醇悬液，因为醇在低温时抑制所有的酶活性。
   9：阳离子 (Ca, Mg)  在含这些离子时，80℃加热5分钟会导致RNA被剪切，故如果RNA需要被加热，保存液需要含螯合剂(1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。
   10：后续实验所用的酶  酶均有可能被Rnase污染。

RNase 和 DEPC 处理
   1：高压灭菌是可以灭活部分RNase A 的。实验证明：37℃与RNA反应，没有灭菌的PBS活性点为100 pg/ml，灭菌后的活性点为100ng/ml。当然，灭菌后RNase 仍然不能认为没有残留。
   2：DEPC在水中半衰期为30分钟。经15分钟灭菌后可以认为彻底破坏了0.1%DEPC中的DEPC，破坏后可以闻到一点气味。
   3：在1M Tris, 1M HEPES, 1M MOPS 中分别加入1ug/ml Rnase A和0.1%及1%DEPC。实验结果提示，0.1% DEPC只对MOPS有效，而1% DEPC对三种试剂都有效。
   4：0.01%DEPC，0.1% DEPC，1% DEPC有效去除的RNase A的浓度分别为：100ng/ml，500ng/ml，1 ug/ml。但要注意，DEPC 灭活后的副产品，对有些后续实验是有影响的。

RNA 抽提的10大窍门
   1：快速阻止Rnase活性样品收集后快速冷冻，裂解时快速操作灭活Rnase。
   2：选择合适的抽提方法高核酶含量的组织，脂肪组织最好用含苯酚的方法。
   3：预判质量要求Northern，cDNA文库构建对完整性要求高，RT-PCR,RPA(Ribonuclease protection assay) 对完整性要求不是很高。RT-PCR对纯度(酶抑制物残留)要求很高。
   4：彻底匀浆是提高得率和降低降解的关键。
   5：检查 RNA 的完整性  电泳检测，28S:18S =2:1是完整的标志，1:1对大部分实验也是可以接受的。
   6：去除 DNA  用于 RT-PCR, array analysis 最好用Dnase I去除DNA。
   7：降低外源酶的污染  不能从外面又导入酶。
   8：低浓度的核酸浓缩时，要加入助沉淀试剂。但要防止助沉淀剂含酶及DNA污染。
   9：彻底溶解 RNA，必要时可以65℃加热5分钟。
10：合适的保存方法 – 短时间可以–20℃保存，长期请保存于–80℃。
提高 RNA 得率
   首先要意识到不同得样品其RNA含量差别很大。高丰度(2-4ug/mg)的如肝脏、胰腺、心脏，中丰度(0.05-2ug/mg)的如脑、胚胎、肾脏、肺、胸腺、卵巢，低丰度(<0.05ug/mg)的如膀胱、骨、脂肪。
   1：裂解细胞使RNA释放出来，RNA如果不被释放出来，得率是会降低的。电动匀浆比其它匀浆方法效果更好，但也可能需要结合其它得方法，如液氮捣碎，酶消化(Lysozyme/Lyticase) 。
   2：抽提方法的优化。基于苯酚的方法的最大问题是分层不彻底和部分RNA的丢失(不能全部将上清取出)。分层不彻底是因为核酸和蛋白质含量高，可以用增加裂解液用量或者降低样品量解决。脂肪组织要增加一步氯仿抽提。RNA的丢失可以用反抽方法或者去除有机层后再离心的方法降低。基于柱离心式方法的最大问题是样品过量。

经典抽提小技巧
   1：Phenol纯化：将等体积的Phenol/Chloroform（1:1）加入，剧烈混匀1-2 分钟，高速离心2分钟，小心取上清(80-90%)，绝不能取到中间层。可以使用等体积的反应液加入 Phenol/Chloroform 中，同样再取出上清。将两次的上清混在一起用于核酸沉淀，可以提高得率。混匀时不能太温和，也不要试图取出全部上清。
   2：70-80% 乙醇洗涤：洗涤时，一定要将核酸悬浮起来，才能保证残留的盐被洗去。同时，在倒掉乙醇后，立即高速离心数秒，再用移液器去除残留的乙醇。室温静置 5-10分钟后，溶解。
特殊组织的抽提
纤维组织：心脏/骨骼肌等纤维组织抽提RNA关键在彻底破碎组织。这些组织细胞密度低，故单位重量的组织RNA的含量就少，最好用尽可能多的起始量。一定要在冷冻条件下将组织彻底磨碎。
蛋白/脂肪含量高的组织：脑/植物脂肪含量高，PCI抽提后，上清含白色絮状物，必须用氯仿再次对上清进行抽提。
核酸/核酶含量高的组织：脾/胸腺等核酸和核酶含量很高。在冷冻条件下碾磨组织，再快速匀浆，能有效灭活核酶。但如果裂解液太粘稠 (因为核酸含量高的缘故)，PCI抽提不能有效分层；加入更多裂解液可以解决此问题。多次PCI抽提可以去除更多残留的DNA。如果加入醇后马上有白色沉淀形成提示有DNA污染。溶解后用酸性PCI再次抽提，可以去除DNA污染。
植物组织：植物组织比动物组织更为复杂。一般，大家都是在液氮条件下对植物进行碾磨的，所以内源酶作用使RNA降解的现象不常见。如果降解问题不能解决，几乎可以肯定是样品中的内含杂质导致。许多植物的内含杂质都会残留，之所以残留，往往是因为这些杂质与RNA有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。这些特点决定了它们是非常强的酶抑制剂。目前，商品化的RNA抽提试剂经过调整大部分可以适合几乎所有的动物组织，适合大部分植物组织RNA抽提试剂相对少一些。
样品冻融的影响
冷冻的样品可能较大，用于抽提RNA之前，需要切割。切割过程中样品往往出现融化。冷冻的样品抽提RNA前可能还要称重，这个过程肯定会出现融化。有时候，液氮碾磨过程中也会出现样品的融化；或者冷冻样品不经过液氮碾磨直接加入裂解液中，在彻底匀浆前肯定会出现融化。实验表明，冷冻组织在融化过程中比新鲜组织更容易发生RNA的降解。可能的原因是：冻融过程破坏了细胞内的结构，使内源酶更容易与RNA直接接触。
RNA质量的判断
通常，使用电泳判断RNA的完整性，使用A260/A280 判断RNA的纯度。理论上，完整的 RNA 拥有28S:18S = 2.7:1 的比例，大部分资料则强调 28S:18S = 2:1 的比例。事实是，除了细胞外，从其它样品中抽提的RNA几乎都得不到2:1 的比例(此结论使用 Agilent Bioanalyzer 获得)。RNA的电泳结果受许多因素的影响，包括二级结构、电泳条件、上样量、被EB饱和的程度等。使用非变性电泳检测RNA，以DNA Marker做对照，如果2kb处的28S和0.9kb处的18S条带清晰，且28S:18S > 1，该完整性可以满足绝大部分后续实验要求了。A260/A280是一个给大家带来许多困惑的指标。首先要明确该指标用于核酸的原始含义是：纯的RNA，其A260/280 = 2.0 左右。纯RNA是‘因’，A260/A280 = 2是‘果’。现在大家却在拿A260/A280当‘因’用，认为“如果 A260/A280 = 2，所以 RNA 是纯的”，自然会产生困惑。有兴趣的话，可以在您的RNA样品中加入一点抽提中经常使用的试剂，如苯酚、异硫氰酸胍、PEG 等，再测A260/A280比值。现实是，许多抽提RNA时使用的试剂，以及样品中的许多杂质都在A260和A280处附近有吸收，对 A260/A280产生影响。目前最具有指导性的做法是：对RNA样品在200-300 nm范围扫描。纯 RNA的曲线具有如下特点：曲线平滑，A230和A260是两个拐点，A300接近0，A260/A280 = 2.0左右，A260/A230 = 2.0 左右。如果没有扫描数据，也一定要测定A260/A230 比值，因为该比值对所有影响酶反应的杂质的残留更敏感。要考虑设备的线形范围 (A260 要处于 0.1 – 0.5 之间)。另外有两个有用的现象：在水中测定 A260/A280，比值将变低 0.3 左右；而在 10mM EDTA 中测定的比值比在 1mM EDTA 中测定的高 0.2 左右。

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