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cwq921

银虫 (正式写手)

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专业: 生物大分子结构与功能

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CD47是一种在肿瘤细胞表面高表达的膜蛋白，其能与巨噬细胞表面的CD47的受体--信号调节蛋白α（Signal Regulatory Protein α，SIRP α）结合，释放“不吃我”信号，抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，导致肿瘤细胞免疫逃逸。有研究表明，活化的T淋巴细胞中膜蛋白CD47高表达，其通过与血小板反应蛋白1（Thrombospondin-1，TSP1）结合，抑制T淋巴细胞的增殖与活化，进而影响T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。因此，封闭细胞表面的CD47将有助于维持巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬以及T淋巴细胞的增殖与活化。
在本课题中，我们将来自于SIRPα突变株CV1、具有高亲和力结合CD47的作用的肽段和人类IgG1的Fc段三段基因融合，命名为SF基因，将SF融合基因嵌入到35型非增殖型腺病毒的基因组中。利用构建的腺病毒Ad35-SF感染T淋巴细胞，表达并分泌SF蛋白从而封闭细胞表面的CD47，探寻当T细胞膜蛋白CD47被封闭之后，T细胞功能的一些变化。本实验选用Jurkat细胞作为研究对象，探索被封闭CD47的Jurkat细胞对肝癌细胞杀伤效率影响，病毒Ad35-SF感染CTL或是CIK细胞后，T细胞活性的改变。主要方法及结果如下：
（1）筛选在T细胞中高效启动的启动子以及探索35型与5型腺病毒对T细胞的感染效率的高低
通过双荧光素酶报告系统检测方法检测筛选出启动子TCEF1α（in）在Jurkat T细胞中启动活性最高；通过免疫荧光技术以及流式细胞术检测不同纤毛类型的腺病毒对T细胞的感染效率得出，35型腺病毒感染Jurkat T细胞的能力优于5型腺病毒。
（2）重组腺病毒载体Ad35-SF的构建、鉴定及在HEK293细胞中的检测融合基因SF的表达
利用分子克隆技术构建了Ad35-SF，通过PCR对其进行鉴定，挑选包含目的基因并且几乎不含有野生型腺病毒的克隆；通过Western Blot以及ELISA检测发现Ad35-SF能够有效的感染HEK293细胞并表达SF蛋白。
（3）检测病毒Ad35-SF对Jurkat细胞以及CIK细胞功能的影响
Western Blot结果表明：Ad35-SF能够感染Jurkat以及CIK细胞并分泌SF蛋白。ELISA实验证实Ad35-SF感染Jurkat细胞48小时后上清中SF的表达量可到达19.1 μg/ml；通过流式检测，通过重组腺病毒Ad35-SF表达的融合蛋白对CIK细胞以及Jurkat细胞表面CD47均有良好的封闭效果。Ad35-SF（MOI=1）感染Jurkat细胞18小时后，细胞CD47阳性比例从97.06％下降到15.32％；当Ad35-SF感染复数增加至5,10时，CD47阳性比率分别将至2.94%和1.73%。
（4）封闭CD47后对Jurkat细胞的功能影响
通过CCK8方法检测Jurkat细胞的增殖以及对肿瘤细胞的杀伤作用，结果表明：相较于空病毒对照组，Ad35-SF感染Jurkat细胞后，48 h后Jurkat细胞增殖效果提高了29％，同时要高于没有病毒感染组。感染Ad35-SF的Jurkat的细胞对肝癌细胞株Hep 3B的杀伤作用提升25.6％（p<0.01）。
以上结果表明构建的重组腺病毒Ad35-SF能有效感染Jurkat细胞并在其内表达分泌融合蛋白SF，封闭Jurkat细胞表面的CD47分子能够有效的提高Jurkat细胞的增殖能力和对肝癌细胞Hep 3B的杀伤作用。
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