| 查看: 704 | 回复: 3 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
[交流]
双酶切连接反应之全攻略
|
|||
|
双酶切连接反应之全攻略 前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了 很多次，不过很快改善了 实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：http://img.dxy.cn/upload/2006/08/13/31219184.pdf。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。 pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524µg。 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题 1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度. 2 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干 3对照的设立： 为验证双酶切是否成功,可做如下对照: A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功. 做转化时,也要进行对照. 设4个: A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下. B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒 C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误. D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况. 4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。 经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的 挑克隆中，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。。。。。。 希望大家不断补充。 |
回复此楼» 猜你喜欢
299求调剂
已经有8人回复
-
一志愿北京理工大学本科211材料工程294求调剂
已经有6人回复
-
300求调剂，材料科学英一数二
已经有8人回复
-
招收生物学/细胞生物学调剂
已经有5人回复
-
070305高分子化学与物理 304分求调剂
已经有7人回复
-
289求调剂
已经有13人回复
-
一志愿哈尔滨工业大学材料与化工方向336分
已经有9人回复
-
081200-11408-276学硕求调剂
已经有6人回复
-
调剂求院校招收
已经有5人回复
-
调剂310
已经有8人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
yangym1123
木虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 1963.2
- 帖子: 230
- 在线: 30.2小时
- 虫号: 397777
- 注册: 2007-06-10
- 专业: 动物形态学及胚胎学
2楼2008-05-28 20:36:31
 |
3楼2008-06-01 01:12:59
4楼2008-06-02 18:26:17
