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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 酶切后连接不上怎么办???
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paulajjh

木虫 (著名写手)

[交流] 酶切后连接不上怎么办???

各位虫友,大家好.我的酶切位点为NdeⅠ与XhoⅠ,很多人都说这两个位点切出来后,很难连接.我已经做了很多次,每次只有阴性板长菌,阳性板从来没有长出过.
第一次,我用的是单酶切,先NdeⅠ,后XhoⅠ,转入BL21与DH52,阴性板为不加PCR的质粒自连.用Amp板筛选.
后几次都是先NdeⅠ,再NdeⅠ与XhoⅠ一起切,还只是阴板长菌.
    各位高手,能否给我分析一下原因吗?给我些建议和帮助好吗?



谢谢大家了
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1楼 2008-05-25 12:57:02
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fengkai6200

银虫 (小有名气)
酶切应该问题不大
即使效率不高也有切开的。
通常都是过夜连接吧。
一定会有连接上的质粒，然后转化，这都没什么好说的。
不长阳性菌，很可能是你涂板的菌太少，所以建议你把菌离心浓缩一下，
然后全涂板了。应该会长出来几个的。
最后别忘了菌落pcr排除载体自连。就可以测序进一步确认了。
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2楼2008-05-25 14:54:56
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