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【重金】———SRB法相关知识———【有效期至2008年5月26日】
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[ Last edited by xjxlovelxl on 2008-5-23 at 23:53 ] |
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pool1296
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xjxlovelxl(金币+5,VIP+0):谢谢您~
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抗肿瘤药物的筛选是抗肿瘤药物研究工作中非常重要的一个环节，建立合理的筛选体系，发现新的抗肿瘤药物，是肿瘤药物研究的一项重要课题。MTT法和SRB法是抗肿瘤药物体外筛选中常用的两种方法。MTT法分析以代谢还原溴化四氮唑蓝(MTT)为基础，活细胞的线粒体中存在脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色的可溶于二甲基亚砜(DMSO)的甲簪(Formazan)化合物,死细胞中此酶消失，MTT不被还原。通过测定颜色变化的深浅来测定肿瘤细胞受影响的情况[56,57]。MTT法操作简便、敏感，可重复性及信号-噪音比好。磺酰罗丹明 B(Sulforhodamine B，SRB)是一种蛋白质结合燃料，可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其颜色变化与活细胞蛋白称正比。SRB法用三氯乙酸固定后可随时用SRB染色作蛋白测定，而SRB用三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解后也可稳定一个较长的时期（这里讲的就是原理了）。SRB特别适用于大规模筛选药物。 两种方法各有优劣。其中最常用的是MTT法，但却易受多种因素如培养基酸碱度、葡萄糖含量、溶剂DMSO的纯度等影响，另外，溶解后的甲簪不稳定，随时间推移而发生光密度变化，也是其主要缺陷；SRB法所用染料SRB属于蛋白染料，不能区分死细胞与活细胞，操作步骤也较MTT法烦琐，但染料稳定，便于标准化，是美国国立癌症研究所60种细胞株大规模筛选所选用的方法。由于作用原理不同，两种方法的测定结果会有一些差异。 与MTT法相比较，SRB法操作所需的时间更短，TCA固定细胞需1 h，SRB染色仅需10～30min，而MTT法中细胞加入MTT以后，还需4 h。而且，SRB 法并不一定要在一段固定的时间内完成全部操作，即没有严格的时间限制性，TCA固定后或SRB结合后的细胞均可以存放，到合适的时间再检测，其OD值仍很稳定。样品保存7天，测定其OD值下降不超过2%，而MTT法必须一次完成全部操作。此外，SRB法比MTT法更灵敏，若一孔中仅有150个细胞，用SRB法可检测出，而MTT法却不能测出。 方法如下： 将对数生长期的细胞用胰酶消化后配制成浓度为2×10E4个/ml的细胞悬液，按1000个/孔接种于96孔板，每孔加100μl(这个要根据你的给药量和药物浓度了)。培养24h后加入待测药物，同时测定此时细胞的OD490值(To)。加药72h后进行测定：每孔加预冷的50％ TCA液50μl固定(TCA终浓度10%)，静置5min，将96孔板移至4℃放置1h；倒掉固定液，去离子水洗5遍，空气干燥后，每孔加SRB液100μl(用1％醋酸配成4mg/ml溶液)，室温放置10min；1％醋酸洗5遍，空气干燥后，加150μl 10mmol/l非缓冲Tris碱液(pH 10.5)溶解，稳定10min后测定OD490nm值。按中效方程计算细胞50％生长抑制所需的药物浓度(GI50)；细胞完全生长抑制所需的浓度(TGI)；杀死50％细胞所需药物浓度(LC50)。 公式： 生长率%= [(T-To)/(C-To)]×100% 细胞杀死率%= [(T-To)/To]×100% GI50：即[(T-To)/(C-To)]=50% 时的药物浓度 TGI：即T=T0时的药物浓度 LC50：即[(T-To)/To]= - 50% 时的药物浓度 注：C表示对照组细胞的OD值 T表示加药组细胞的OD值 To表示加药时对照平板细胞的OD值 试验过程中应注意以下问题：(1)接种时细胞的浓度和均匀程度；(2)孵育应在全湿条件下，否则会因为干燥而影响培养板四周孔的OD值；(3) 测定OD值前应在平板震荡器上摇匀；(4)对大多数细胞来说，测定OD值的波长可为490～570nm。 [ Last edited by pool1296 on 2008-5-24 at 00:10 ] |
2楼2008-05-24 00:08:06