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关于HBV DNA提取？
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wjswj
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3楼2008-05-23 14:56:58
wjswj
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经典的核酸提取方法通常是加去污剂（SDS等）裂解细胞，经蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。 由于样本的处理及保存对DNA和RNA（尤其是RNA）的影响较大，因此在核酸测定时标本的处理及适当保存对测定结果的准确有效非常重要。 临床常见的标本有血清（浆）、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、新鲜组织、石蜡切片等，这些临床标本的处理和保存方法各有不同。 血清（浆）标本 一些病原体，如乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）等的PCR检测常采用血清或血浆标本。 HBV：标本通常由医护人员采集，应注意避免溶血，如为血浆标本注意抗凝剂的选 择，一般用EDTA-Na2或枸橼酸纳，不可使用肝素。标本为全血时，及时分离出血浆，提取病毒DNA进行检测。 全血标本 通常用来提取外周血单个核细胞核酸：如基因组DNA、线粒体DNA、总RNA等。 抗凝剂：一般使用EDTA-Na2、枸橼酸纳，不使用肝素。 前处理： 1）加适量的红细胞裂解液（破膜液），裂解全血中的红细胞。 2）再加适量的细胞核裂液（破核液），裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA 释放出来。 3）然后再加SDS（十二烷基硫酸钠）等去污剂，溶解脂蛋白，解聚核蛋白。 SDS可与蛋白 质结成复合物，使蛋白质变性沉淀，但SDS在以后的核酸提取过 程中必须除去。 体液 体液标本，包括胸水、腹水、脑脊液、尿液等，可直接离心，取沉淀物提取核酸。 血性胸腹水，可使用红细胞裂解液处理： 加等体积红细胞裂解液，震荡混匀，置5-10分钟 ↓ 10000rpm，离心5分钟，弃上清 ↓ 可根据情况重复2-3次，沉淀物用于DNA提取 组织 组织有新鲜组织和石蜡切片。 新鲜组织的处理步骤： 先用生理盐水洗二次，然后将其捣碎或剪碎（用眼科剪），加蛋白酶K消化后提取核酸 石蜡切片用于核酸提取，需先用二甲苯脱蜡，再用蛋白酶K消化后进行DNA提取。 |
2楼2008-05-23 14:14:04
4楼2008-05-23 16:36:32
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