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PacBio长读长致力医学研究
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供体源性感染黄金审判：PacBio助力感染菌株基因组重测序 ——Genomeweb Andrew Kasarskis访谈录 Andrew Kasarskis博士是Icahn基因中心遗传与基因组中心的副主任。他目前领导着一些专攻治疗和诊断的合作项目，而他自己的研究也主要在病原体检测，药物基因组学，睡眠与遗传的关系几个方面展开。在加入西奈山之前，他曾经就职于PacBio，Sage Bionetworks和Merck。他有超过10年的研发和项目管理经验。 2014年10月8号，Genomeweb对Arew Kasarskis博士就测序平台在检测供体源性感染的作用进行了探讨。根据最新的两起病例报道，全基因组测序（WGS）在这方面起到了非常重要的作用，让医生明白从已感染的供体移植器官是一件多么危险的事情。 第一个病例是由美国疾病控制和预防中心（CDC）报道的，并且9月份已经在American journal of Transplantation发表。他们通过WGS的方式确诊，有2名病人分别移植了同一名受感染的供体器官，结果都发生耐甲氧西林金葡菌（MRSA）感染。另一个病例，是西奈山的研究人员独立报道，也是通过WGS确诊一名受体病人由于移植了一名受感染供体的肝脏导致MRSA感染。两起报道都认为，有限的可供移植器官和越来越庞大的等待器官移植的病人名单给医生很大的压力，使他们不得不考虑移植明知已经感染供体的器官。目前，急需一份有力的数据，来说明移植这种已感染器官的风险以及这种移植方案后续带来庞大治疗支出。至今为止，只有几例疑似供体源性感染的病例使用精确的方法确诊，例如WGS，而其它的案例都是基于其它相对不太准确的数据进行诊断。这些不准确的数据对于统计准确的移植传输病原感染率，移植风险，后续治疗费用计算带来了阻碍。 Andrew Kasarskis曾对Clinical Sequencing News说：“现在，我们还无法给出这方面的临床应用指南，因为我们缺乏数据，我们不确定从一个已被感染的供体体内取出器官移植到另一名受体身上到底有多大的风险。”据Kasarskis说，以前那些低分辨率的检测手段，大部分现在已经弃之不用，因为他们不能为疑似供体源性感染的案例提供可信的证据。“以前我们常用多位点序列分型（MLST）的方法来鉴定的病原体克隆，例如，你通过MLST可能分析得到这是一个USA300的克隆。但是，问题在于每个医院到处都漂浮着类似的病原，你无法区分这个克隆是来自移植传输还是其它什么地方。” 在第一起报道中，焦点在于在2个感染MRSA的受体病人中，都接受了同一个供体的器官，一个是肝脏移植，一个是肺部移植。检测出来的病原体都是USA300，除了测序，没有任何一种其它技术可以确定这个菌株是否都来源于供体，还是来源于医院其它方面的感染。所以CDC的研究人员使用Illumina MiSeq的技术对2个受体病人分离的MRSA和他们共同的供体分离的MRSA进行了测序，结果说明3个菌株非常相似，而且明显区分于医院分离的其它MRSA。 在第二期报道中，西奈山的研究案例是从一个MRSA感染的二尖瓣心内膜炎供体移植肝脏后，受体也发生了移植后的MRSA感染。研究人员使用PacBio RSII对供体和受体分离的MRSA进行了长读长的测序并完成了Denovo的组装，结果证明2个分离菌株的序列100%相同，是一个非常确凿的用来证明供体源性感染的证据。 在这两起报道中，相同的情况是供体和受体分离的菌株，都是MRSA的USA300。而美国几乎所有医院获得性的MRSA菌株都是USA300，所以，必须使用全基因组测序并在此基础上进行拼接组装才能够确定受体的分离株是否是供体来源。Kasarskis认为：“测序可以给出无可置疑的结果，告诉我们受体的病原是否来自供体。”“而这部分工作对于弥补从被感染的供体移植器官是否符合临床安全的数据也非常重要。” 在第一起报道中，CDC的研究人员也提到，2个被感染的受体都进行了抗生素治疗，但是随后其中之一已经治疗完毕并出院的受体病人的MRSA复发了，这说明我们现有的治疗标准对于预防细菌传输还是不足的。同一个供体的器官，肾和胰腺也移植给了另外两个受体病人，而移植后进行了预防性的抗体治疗，他们并没有出现MRSA感染的迹象。 两起报道中都强调，测序是确定供体源性感染非常好的手段，也有助于理解传输发生的负责模式，促进临床的治疗模式，预防MRSA或者其他细菌在移植或者其他临床领域的扩散。 突破性进展：如何追踪抗生素耐药细菌抗性基因的来源？ 根据世界卫生组织（WHO）报道，“抗抑菌剂基因的出现对于由细菌、寄生虫、病毒及真菌所引起的感染疾病的预防与治疗带来了很大的挑战，在后抗生素时代，看似普通的感染有可能扼杀一条生命不再是不切实际的幻想，而正逐渐变为现实”。 通常抗抑菌剂基因的获得是由细菌内可动遗传因子元件介导的致病菌间或者是致病菌和共生体间交换的结果，因此，获得抗抑菌剂基因所处的遗传环境对于了解抗抑菌剂基因的移动就显得非常重要。通过PCR或高通量二代测序的方法可以很容易检测到抗抑菌剂基因的存在，然而这些方法自身的一些局限性使得其很难精确地检测这些基因所处的遗传环境。而PacBio RS II SMRT单分子测序技术，利用其特有的读长优势可以克服这些局限从而追踪含抗抑菌剂因的致病菌在医疗环境中的传播。 细菌间遗传因子的水平转移是通过由细菌染色体所分离出来的质粒、小DNA分子来实现的。Conlan等科学家通过对2011年美国NIH临床诊断中心爆发的那次疫情中病人中分离到的致病菌进行PacBio长读长测序分析，鉴定出致病菌质粒含有blaKPC基因，该基因可以编码碳青霉烯酶从而水解碳青霉烯抗体。Conlan又对1000多个感染抗碳青霉烯抗体致病菌病人进行监测，从这些病人中分离出细菌基因组并进行PacBio SMRT长读长测序分析，得到了63个质粒的完整序列，这些完整的质粒序列信息让我们对致病菌质粒的多样性有了具体的了解，而这些是任何其他测序方法所不能完成的。 质粒在抗抑菌剂基因的转移中起着关键的作用，抗抑菌剂基因通常以模块化的基因簇形式聚集在一起增加了它们的抑菌性。一些插入序列，如IS26，将抗抑菌剂基因在基因组序列张间隔排列，像转座子一样可以到处移动；还有一些因子，如ISEcp1，可以移动其相邻的基因，从而产生许多抗抑菌剂基因拷贝存在于基因组内。这些插入序列及其他一些因子的存在是二代测序基因组组装不完整的主要原因，只能得到许多染色体序列片段及质粒序列片段，在这种意义上说，质粒序列信息是二代测序基因组组装的“黑洞“，在许多基因组组装研究中都要规避复杂结构的质粒的存在。Colan等在本研究中的基因组比较结果表明抗抑菌剂基因的结构及序列排列信息只有通过PacBio长读长测序获得完整质粒序列信息的情况下才能够拿到。 传统的Sanger测序是组装和分析抗抑菌剂细菌质粒的金标准，然而这种方法在测序前需要分离和构建不同的高质量的质粒文库，在技术层面存在很大困难，并且成本也非常之高。短序列测序的二代测序可以很经济地获得很多有重复序列所分割的Contig，由于这些重复序，通常是些移动因子（如插入序列），在质粒中存在很多拷贝，因此在组装完整质粒序列方面就存在很大困难。从任何细菌中获得抗抑菌剂基因都可以很容易地做到，但是如何将这些质粒中的序列完整地组装起来是最大的困难，而组装完整的质粒序列对于我们在临床上理解这些基因是如何传播的非常关键。作为比较， PacBio长读长测序可以使我们获得完整的细菌质粒图谱，包括数量、位置及抗抑菌剂基因的移动因子等具体信息。这些信息也极大地帮助我们去理解质粒的运输、转移、流行病及进化情况。 关于Pacbio RS II测序系统 天津生物芯片于2013年引进国内首批PacBio RS II测序仪系统，将PacBio RS II测序平台与二代测序平台相结合， 目前可以达到平均8K以上的读长，它应用于小基因组完成图、动植物复杂基因组组装、表观基因组学、全长转录组测序等方面。 原理 1. 用4种荧光分别标记4种dNTP 2. 在测序芯片的底部做出许多用与入射光波长相应的小孔，特定的孔径保证了入射光在小孔中只以走很短的矩离。只够照到正好与酶在相互作用的荧光dNTP底物 3. 把聚合酶锚定在测序芯片的底部 4. 让DNA链与酶结合，进行测序 5. 测序时，荧光dNTP与酶+DNA模板型成复合物，短暂结合 6. 荧光dNTP被激光照射，发出荧光，荧光被检测到 7. 酶反应过程，一方面使链延伸，同时使dNTP上的荧光基团脱落 8. 聚合反应持续进行，测序同时持继进行 |
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