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havedear木虫 (正式写手)
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[交流]
紧急求助--用酵母双杂交还是用pull-down
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我目前的工作是寻找植物病原菌的效应分子在植物体内的靶标蛋白，但我现在面临一个问题，是用酵母双杂交还是用pull-down的方法。 pull-down与酵母双杂对比分析： pull-down的方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，基本符合体内实际情况，相对酵母双杂交来说，得到的蛋白可信度高。 pull-down相对酵母双杂交非常简单易用，不需要建库，制作感受态大肠杆菌。 pull-down即可检测可能与饵蛋白相结合的蛋白，非常省时间，而酵母双杂交最快需要一个月时间。 pull-down还可以检测到膜蛋白，而酵母双杂交不能。 从经济上说，酵母双杂交需要昂贵的建库试剂盒，和四缺培养基（一般一次试验药用一瓶，500元）而Pull Down试剂盒四千元，能做数十次。测序的费用Pull Down和酵母双杂交是基本相同。 Pull Down假阳性率低，酵母双杂交假阳性率高。 还有一个问题，烟草的蛋白组背景还不是很清楚，通过pull-down的方法得到的靶蛋白如果是前人没有报道过的，那么也许不能根据它的蛋白序列推测出它的基因序列？ 酵母双杂交唯一的优势是：Pull Down不容易得到瞬时作用的蛋白，而酵母双杂交可以。 这里我有几个问题要问： pull-down最后一步是洗脱，洗脱条件不同，严格条件下可能损失掉目的蛋白，宽松条件下可能混杂非目的蛋白？我听过很多实验室最后用煮沸的方法释放蛋白，这样对结果的专一性影响不是太大吧。 你们有很多利用pull-down来筛选靶标的实验，如果最后得到10个考马斯染色点， 对蛋白质测序后，得到10个不同的蛋白序列，那么一般来说这十个蛋白序列中有多少个在以后的实验中（分析靶标蛋白的功能）有价值？ 还有一个问题就是融合蛋白的Tag的选择，听说你们那里很多用6* His Tag 或 GST Tag 用那种Tag更好呢？ 我们实验室酵母双杂交做得比较多，但没做过pull-down。从以上的分析来看，我认为pull-down有非常多的优势，听说上海复旦医学院，所有实验室都使用pull-down的方法，没有一个实验室使用酵母双杂交。但我看所有的植物病理方面的文章，包括G.B Martin D.G Jones的文章都是选择使用酵母双杂交的方法。实际上多数植物病理实验室都采用酵母双杂交的方法来筛选靶蛋白，最后用pull-down来验证一下。我一直十分奇怪为什么不用pull-down的方法直接筛选靶蛋白，而仅仅把pull-down作为一种补充的验证试验呢？是不是pull-down的方法在植物上使用会有一些我所不知道的重大缺陷呢？？？我应该选择哪种实验方法呢？？ 急切的盼望你们在百忙之中能给我回帖。我说的话如有错误，希望你们能指正。 |
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snzydong
铁杆木虫 (著名写手)
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3楼2008-08-27 11:27:48
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xyklmu(金币+3,VIP+0):积极交流奖
xyklmu(金币+3,VIP+0):积极交流奖
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“实际上多数植物病理实验室都采用酵母双杂交的方法来筛选靶蛋白，最后用pull-down来验证一下。” 我个人理解，可能是这样的： By Pull-down assay, you can get the proeins that interact with the bait protein. The next step you should do is to identify the prey proteins, for example, by MS. Today, protein identification (or sequencing) is much more difficult than nucleic acid identification (sequencing). So, it is likely for you to get a lot of unknown proteins and for these protieins, you can only know some small part of their peptide fragments. Maybe it is the largest disadvantage of pull-down assay. |
2楼2008-08-27 09:08:02
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