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鼠李糖脂的分离提取和定性定量研究——假黄单孢菌
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一、背景介绍 1、前期分离得到一株假黄单孢菌，暂命名为【菌株P】。据16sDNA分析结果绘制系统进化树，知其与已报到的【假黄单孢菌A】同源性达100%。已知A能产生具有表面活性的物质，但未指明其具体结构（2006）。 2、另一报道称【假黄单孢菌B】亦能产生表面活性物质，质谱分析鉴定其结构为鼠李糖脂。这是第一篇关于假黄单孢菌产鼠李糖脂的报道（2009）。 3、目前用于鼠李糖脂研究、生产的菌种几乎都是铜绿假单胞菌，而关于假黄单孢菌代谢产物的表面活性研究相对较少。 4、预实验目的：第一，验证【菌株P】是否产表面活性物质；第二，若产，其类型是否为鼠李糖脂。 二、已开展的工作 1、按照【假黄单孢菌B】和【铜绿假单胞菌H】的配方分别进行了两次发酵，接种量分别为4%和10%。两次发酵均为唯一碳源实验，分别选用了玉米油、花生油和葵花籽油，其他成分相同。【假黄单孢菌B】配方所得发酵液为【乳白色】，【铜绿假单胞菌H】配方所得发酵液为【棕黄色】。 2、排油圈实验：9cm培养皿内加入20mL去离子水，上加400uL液体石蜡，并使之均匀分散形成油膜，加入50uL发酵液。约1s迟疑后，立刻形成排油圈，但圈过大，最终能将液体石蜡挤到正中央聚集成团。 3、【假黄单孢菌B】配方所得【乳白色】发酵液的分离提取：用6M HCl将发酵液的pH调至2，4℃冷藏过夜，离心去除白色絮状沉淀，取上清液用等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机相45℃旋蒸，蒸干物用甲醇洗下后挥干，得粗提物【油状液体，颜色为棕红至玫瑰红不等】。将该粗提物10uL溶解于5mL去离子水中，所得溶液的表面张力在26-29mN/m不等。 4、鼠李糖标品配成5mg/mL、500ug/mL、50ug/mL和5ug/mL【水溶液】，200-800nm全波长扫描均未见吸收峰。 三、质疑： 1、有文献提到，可通过发酵液的颜色及深浅大致判定表面活性产物的类型和含量高低，可否详细说明？ 2、排油圈：我把发酵液换成玉米油、花生油和葵花籽油，想做阴性对照，但为神马也能产生排油圈~~o(>_<  o ~~是油相不应该选择液体石蜡？还是液体石蜡太少？还是………3-1、分离提取：发酵液调到pH=2时产生的白色絮状沉淀是什么？有文献说鼠李糖脂在pH=8时溶解度最大，在pH=2时溶解度最小，那么发酵液调pH为2后就应该收集絮状沉淀而不是取上清液继续萃取咯？那为什么我的萃取物能表现出表面活性呢？ 3-2、分离提取：粗提物的颜色为棕红到玫瑰红不等，并非文献所说的棕黄色油状物，是否与我的菌株本身会产红棕色的色素有关？这种色素在原来配方的培养基中确有产生，但水溶性很好并有很强的吸湿性，醇溶性极差、微溶于乙醇、几乎不溶于石油醚。那么这种水溶性的色素又是如何跑到甲醇中去的呢？是否产生了新类型的色素？ 4、全波长扫描：鼠李糖在可见光区应该有吸收峰，480nm、620nm均有人提及，为什么我没有扫出来吸收峰，而是一个大L型曲线？（酶标仪紫外扫描） 5、定量研究：求问测过鼠李糖脂含量的各位师兄师姐，苯酚硫酸法和硫酸蒽酮法哪一个可操作性强？ 首次发帖的小硕跪求指导 |
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