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新虫 (初入文坛)

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[求助] 大家帮我看看我的WB图以后做时还需要注意什么

我做的一个大鼠指标，用的是ABCAM的一个
兔的多克隆抗体，种属反应是人，但predict to work with：rat，没有更好的，所以就只能用这个试试了。按照常规WB做法，封闭液选择的奶粉，一抗稀释1500倍，二抗国产羊抗兔，稀释5000倍。目的蛋白是33kd，图上由左至右，1234样品都是甲状腺，1和2是一个甲状腺提取的蛋白质，3和4是半个甲状腺。5和6是肝脏。7和8是肾脏。蛋白原液稀释20倍检测浓度，上样前经过计算保证上样量一致，都是正常鼠的组织，只是为了验证下一抗。没做内参。
marker由上到下，分别为70 55 40 35 25 图上上面较亮的一条，分子量约为55和40之间的应该是条杂带吧，不过却非常清晰，下面那条稍暗的条带，与35的marker比较接近，应该是目的条带。
大家帮着看看：
1.这个图总体咋样，实验中还有哪些需要注意的地方，可以使实验图更完美？
2.最亮的那个条带是怎么回事呢，会影响我的实验结果么
3.3和4 条带要比1和2弱，我觉得可能是蛋白浓度测的不准，造成的差异，因为后两个组织是用了半个甲状腺，配置样品时蛋白原液1和2大约是50ul，3和4大约是65ul，虽然是根据浓度算的，但并没有增加一倍蛋白量。

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