24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 651  |  回复: 4
当前主题已经存档。
【有奖交流】积极回复本帖子,参与交流,就有机会分得作者 shenjj1983 的 5 个金币
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

shenjj1983

新虫 (小有名气)

[交流] 求助关于定点突变的问题,急!

我最近做定点突变,用的是大引物法 mega-primer,但是结果是该突变的位点突变掉了,不该突变的地方也有两三个碱基发生了改变,我用的是高保真酶,不知道是什么原因啊,请高手赐教!
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

henghengyouyou

银虫 (正式写手)

请问,我的EMS诱变的材料可不可以用到这个定点突变试剂盒,我什么都不知道现在,只是知道我的材料表型有变化,请多指导!
4楼2008-05-14 13:47:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 5 个回答

imdyl

木虫 (初入文坛)

有点突变的试剂盒,如TAKARA,使用的是一步PCR,也可能就是你所说的大引物法,但片断加载体总长控制在5kb之内。
如果你的片断较长,建议使用重叠延伸PCR定点诱变 

需要三个PCR反应来完成。首先以已构建的基础质粒为模板,正向侧引物F和诱变引物Rm,为上下游引物,进行PCR扩增(PCR1),扩增突变位点及其上游序列的DNA片段FRm。同时以诱变引物Fm和反向外侧引物R为上下游引物,进行PCR扩增(PCR2),扩增含突变位点及其下游序列的DNA片段FmR。这两个PCR可以同时进行。各取PCR1和PCR2的产物FRm和FmR为模板,以 正、反向外侧引物F和R为上下游引物,进行第三个PCR。通过第三个PCR,用外侧引物将片段FRm和FmR拼接而成全长含突变位点的产物FR。
2楼2008-05-13 15:13:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (著名写手)

本帖仅楼主可见
3楼2008-05-13 16:58:21
已阅   申请BioEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

shenjj1983

新虫 (小有名气)

谢谢大家的回答,但是你们说的都是重叠延伸法,我的片段加载体接近8K,我想这是不是导致不该突变的位点发生突变的原因呢?还有大引物法要三轮PCR,是不是也导致了碱基错配呢,我用的LA-Taq,是不是它的保真性不够高呢,请大家赐教,万分感激!
5楼2008-06-03 22:20:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 332求调剂 +6 蕉蕉123 2026-03-28 6/300 2026-03-29 00:37 by 544594351
[考研] 一志愿211 初试270分 求调剂 +7 谷雨上岸 2026-03-23 8/400 2026-03-28 21:47 by lbsjt
[考研] 315求调剂 +4 akie... 2026-03-28 5/250 2026-03-28 21:05 by zhq0425
[考研] 本科新能源科学与工程,一志愿华理能动285求调剂 +7 AZMK 2026-03-28 11/550 2026-03-28 21:01 by xxxsssccc
[考研] 295材料工程专硕求调剂 +7 1428151015 2026-03-27 7/350 2026-03-28 19:58 by S240
[考研] 330一志愿中国海洋大学 化学工程 085602 有读博意愿 求调剂 +3 wywy.. 2026-03-27 4/200 2026-03-28 03:32 by fmesaito
[考研] 070300化学求调剂 +4 起个名咋这么难 2026-03-27 4/200 2026-03-27 21:39 by 83503孙老师
[考研] 265求调剂11408 +3 刘小鹿lu 2026-03-27 3/150 2026-03-27 20:53 by nihaoar
[考研] 08开头275求调剂 +4 拉谁不重要 2026-03-26 4/200 2026-03-27 14:12 by Delta2012
[考研] 305求调剂 +5 哇卢卡库 2026-03-26 5/250 2026-03-27 14:01 by laoshidan
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +4 崔wj 2026-03-26 4/200 2026-03-27 08:04 by chemisry
[考研] 304材料求调剂 +4 钟llll 2026-03-26 4/200 2026-03-27 03:42 by wxiongid
[考研] 【双一流院校新能源、环境材料,材料加工与模拟招收大量调剂】 +4 Higraduate 2026-03-22 8/400 2026-03-26 20:34 by Higraduate
[考研] 281求调剂 +6 Koxui 2026-03-24 7/350 2026-03-26 15:37 by 无际的草原
[考研] 环境专硕324分求调剂推荐 +5 轩小宁—— 2026-03-26 5/250 2026-03-26 12:05 by i_cooler
[考研] 26考研-291分-厦门大学(085601)-柔性电子学院材料工程专业求调剂 +3 min3 2026-03-24 4/200 2026-03-25 18:22 by xcjcqu
[考研] 340求调剂 +5 话梅糖111 2026-03-24 5/250 2026-03-25 06:53 by ilovexiaobin
[考研] 一志愿吉大化学322求调剂 +4 17501029541 2026-03-23 6/300 2026-03-24 10:21 by 戴围脖的小蚊子
[基金申请] 请教下大家 2026年国家基金申请是双盲审吗? +3 lishucheng1 2026-03-22 5/250 2026-03-24 08:22 by gltch
[考研] 石河子大学(211、双一流)硕博研究生长期招生公告 +3 李子目 2026-03-22 3/150 2026-03-22 21:01 by 怎么释怀
信息提示
请填处理意见