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求助关于定点突变的问题，急！
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我最近做定点突变，用的是大引物法 mega-primer，但是结果是该突变的位点突变掉了，不该突变的地方也有两三个碱基发生了改变，我用的是高保真酶，不知道是什么原因啊，请高手赐教！ |
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henghengyouyou
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4楼2008-05-14 13:47:10
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有点突变的试剂盒，如TAKARA,使用的是一步PCR，也可能就是你所说的大引物法，但片断加载体总长控制在5kb之内。 如果你的片断较长，建议使用重叠延伸PCR定点诱变 需要三个PCR反应来完成。首先以已构建的基础质粒为模板，正向侧引物F和诱变引物Rm，为上下游引物，进行PCR扩增(PCR1)，扩增突变位点及其上游序列的DNA片段FRm。同时以诱变引物Fm和反向外侧引物R为上下游引物，进行PCR扩增(PCR2)，扩增含突变位点及其下游序列的DNA片段FmR。这两个PCR可以同时进行。各取PCR1和PCR2的产物FRm和FmR为模板，以 正、反向外侧引物F和R为上下游引物，进行第三个PCR。通过第三个PCR，用外侧引物将片段FRm和FmR拼接而成全长含突变位点的产物FR。 |
2楼2008-05-13 15:13:21
3楼2008-05-13 16:58:21
5楼2008-06-03 22:20:00
