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hyf9901铁杆木虫 (著名写手)
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[交流]
高拷贝质粒农杆菌转化总是失败
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高拷贝质粒转化农杆菌总是失败 用pCAMBIA1300 高拷贝质粒 构建的载体（插入自己的启动子带基因全长及自己的3‘区域）转化农杆菌EHA105以及GV3101和pMP90RK统统转不进去，对照和感受态以及操作流程没有任何问题，因为每次阳性和阴性对照一切正常，调整抗性比例和浓度大小也均失败。重新用载体和基因构建三次测序完全正确后再转也不行，换成35s启动子也不奏效。郁闷至极，这个构建和转化做了快2年了。望各位高手帮忙分析讨论，有没有别的办法，这个质粒是要转化植物的，谢谢。   [ Last edited by hyf9901 on 2008-5-8 at 11:37 ] |
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3楼2008-05-08 13:05:36
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构建用的是基因组DNA序列，打成3断分别连接进去的，共长约6Kb，因为单个酶切连入太困难，没有成功才打断连的，即启动子＋基因全长＋3’的0.8K序列，测序完全正确的。打断时最先连入3‘短，接着连入启动子，最后连入基因。对照有4个：阳性对照为pCAMBIA1300原始载体和以前用该载体构建的一定能转入农杆菌Construct，阴性对照为感受态本身（涂加潮霉素抗性的平板），还有一个对照为已经连上3’端和启动子序列的切测序完全正确的Construct。实验组为带了基因的构建，用了3个不同的克隆。热激电激都用过了，结果为：前三个对照一切如愿，第四个对照也正常长克隆，只有试验组每次都失败，一个克隆不长。我以前用该载体做过几十个构建了，这是第一次碰到的怪事，也是我室空前的。以前也曾碰到过几个测序正确的构建转化农杆菌失败，不过那是构建途中说不清什么原因载体丢了一段所致，因为从电泳带型上可以看出，重新构建再转化就成功了，这次载体没有出问题呀。非常希望各路高手指点，不胜感激。 |
7楼2008-05-09 10:10:21