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分子克隆方面问题
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先问一个个人感觉比较菜鸟的问题： 分子方面的那些试剂，比如说PCR方面的mg离子，pcrbuffer，dNTPs等（只是举例，不特指）没有分装，没有在冰上完全冻融，溶一点就开始用，是不是浓度会不对，结果会不会不理想，我原来也是一直这样做没发现有什么不好？近期实验做不出，有人说可能是这个问题。 第二个问题： 本人能够从基因组中p出我一个是理想片段的基因（大概1.5kb），想转到质粒上操作，并测序，总是得不到。 我从基因组上p出片段（没有在引物两端设酶切位点的）来用omega公司胶回收试剂盒回收，有电泳验证过，片段大小正常，亮度比较好。 用takara公司的PMD18T载体连接（做了阳性对照1，内置的500bp的片段），空调下（16度）连接24个小时都有过，然后做转化，还做了阴性对照2（不加连接产物到感受态中），还做了另一个对照3（也不加连接产物到感受态中，涂没amp的板） 结果总是3板长满菌落，2板没菌落，这些都理想，但对照1和我要的板总是只有白板，没有篮板（放4度几小时也没用），而且斑很少，做过菌落PCR（直接挑取的和提取菌液的都做了），还提取质粒了再pcr的都做了，结果验证没有带。 我从获得这个基因到我仅需要把这个基因转到质粒里去这个小小的要求都做了我将近几个月了，真的是各种因素都排除了，还请大家给出宝贵意见 |
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4楼2008-05-08 23:47:58
★ ★ ★
lixiaoyi1981(金币+3,VIP+0):非常不错，鼓励一下。
lixiaoyi1981(金币+3,VIP+0):非常不错，鼓励一下。
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第一个问题： PCR方面的mg离子，pcrbuffer，dNTPs等（只是举例，不特指）没有分装，没有在冰上完全冻融，溶一点那试剂的浓度肯定不准，有些pcr反应对mg浓度是有要求的，如果你加入试剂的浓度都不能保证，你很难知道pcr反应到底在什么条件下合适。所以不理想是很正常的。 第二个问题 3长满菌落，说明感受态没有污染（是没有混有带有抗性的菌） 2没有长出来，说明你的PMD18T载体是线性的，没有成环或污染。 你转的两个板子长不出来，是因为你的产物没有与载体连接成功，或者是你的转化步骤有问题。 |
2楼2008-05-08 16:22:43
mimisikai
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3楼2008-05-08 16:43:30