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我就是保哥哥

金虫 (小有名气)

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3楼: Originally posted by 小冀- at 2014-10-23 11:57:57
我们这里都是用牙签调菌直接接到PCR体系中,如果正确的话肯定可以P得出来的···我最近也在连19T载体,也遇到相同的情况,用PCR扩增的时候没有条带,但酶切可以切出来,也搞不清楚是怎么回事···

我最近也是这种情况,PCR出不来,但酶切的话所有的质粒都可以切下带,你可以用没有酶切的质粒和酶切后的质粒一起跑胶,看看你的质粒切开没有;我的情况是是,我酶切后跑胶的质粒也是切下条带来了(和我准备连接 的大小居然一样),没有酶切的质粒跑胶居然出现了一条杂带,所以我怀疑是这条杂带切下那个片段来了,我就把质粒跑胶后切胶回收了,准备做下一步重新连接,不知道结果怎么样
11楼2014-10-27 17:18:18
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我就是保哥哥

金虫 (小有名气)

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7楼: Originally posted by 灰血动物 at 2014-10-23 15:16:26
给楼主个建议;

将菌落先挑到PCR管中 加部分水,然后用PCR仪95℃加热15分钟,帮助DNA裂解,

虽然程序中含有这一步,但是时间相对较短,裂解的模板更有助于扩增。。。加油

大肠杆菌煮和不煮情况一样,经验人的说法,其他菌的话煮一下可能会好一些
12楼2014-10-27 17:20:26
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小冀-

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引用回帖:
11楼: Originally posted by 我就是保哥哥 at 2014-10-27 17:18:18
我最近也是这种情况,PCR出不来,但酶切的话所有的质粒都可以切下带,你可以用没有酶切的质粒和酶切后的质粒一起跑胶,看看你的质粒切开没有;我的情况是是,我酶切后跑胶的质粒也是切下条带来了(和我准备连接 的 ...

我就是质粒和酶切后的一起跑的,确实切开了,但大小差一点···
···
13楼2014-10-27 19:27:44
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jxtp111524

金虫 (小有名气)

试试  菌液PCR体系:20ul
mix      10ul
引物1  1ul
引物2  1ul
菌液    1ul
水       7ul
   

我一直用这个体系, 和你做的差不多,是不是太省了
努力加油
14楼2014-10-27 19:32:45
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