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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌液PCR
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艾米的小屋

新虫 (初入文坛)

[求助] 菌液PCR 已有6人参与

你好，我最近做基因克隆，将PCR胶回收产物与pMD19-T酶连后，导入DH5a中，蓝白斑筛后，挑单菌落做菌液PCR，做了两次也做不出来，怎么回事呢？
菌液PCR体系：10ul
mix      5ul
引物1  0.5ul
引物2  0.5ul
菌液    1ul
水       3ul
注：我已经不是第一次做基因克隆了，但是从来没有出现过这个问题，实在想不明白，求高人支招，谢谢！
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1楼 2014-10-23 11:13:38
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xhp_1638

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
菌浓度怎样？用1ul是否可行呢？
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发展才是硬道理！
2楼2014-10-23 11:50:52
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-23 12:32:26
我们这里都是用牙签调菌直接接到PCR体系中，如果正确的话肯定可以P得出来的···我最近也在连19T载体，也遇到相同的情况，用PCR扩增的时候没有条带，但酶切可以切出来，也搞不清楚是怎么回事···
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···
3楼2014-10-23 11:57:57
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jian212

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-24 21:02:24
考虑下提取下质粒看看能不能P的出来，易或者你长的菌就不是阳性克隆。。
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学习再学习，努力再努力。
4楼2014-10-23 13:54:18
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852634230

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
直接摇菌抽质粒测序试试吧
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今日你对我爱答不理，明天让你高攀不起
5楼2014-10-23 15:09:47
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灰血动物

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by jian212 at 2014-10-23 13:54:18
考虑下提取下质粒看看能不能P的出来，易或者你长的菌就不是阳性克隆。。

初步筛选提取质粒工作量太大了
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未完成
6楼2014-10-23 15:14:10
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灰血动物

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-24 21:02:15
给楼主个建议；

将菌落先挑到PCR管中 加部分水，然后用PCR仪95℃加热15分钟，帮助DNA裂解，

虽然程序中含有这一步，但是时间相对较短，裂解的模板更有助于扩增。。。加油
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未完成
7楼2014-10-23 15:16:26
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灰血动物

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xhp_1638 at 2014-10-23 11:50:52
菌浓度怎样？用1ul是否可行呢？

楼主用的是一个菌落，跟菌浓木有关系吧
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未完成
8楼2014-10-23 15:17:17
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去哪里看海

铁虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-24 21:02:05
将单菌落用0.25% 的SDS处理，热击和冰浴五分钟，三个循环，得到粗提的基因组，作为模板可以试试
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9楼2014-10-23 16:42:11
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393658000

金虫 (小有名气)
各种写体积，我表示无能为力
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10楼2014-10-27 10:13:17
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