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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » Tail-PCR结果，请高手分析下
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yangxiaofei

[交流] Tail-PCR结果，请高手分析下

我做了一个克隆启动子的Tail-PCR,SP1,SP2,SP3退火温度为63，59，59第一轮62.8，64.7度，第二三轮58.7度时P到了相同的带，附件1的第18，19为62.8，58.7度的第二三轮产物带，附件2的7，8为64.7，58.7度的第二三轮带，我拿其中的第三轮带测序得到的是SP3 P出的带，而AD没有结合上去，我现在确定第二轮的带肯定不是AD P出的，已经验证过了。我很奇怪的是第二轮的带是什么？如果是SP2和SP2的产物，那它和第三轮的带长度为什么那么相同？若是AD和SP2的产物，第三轮也该能结合上去。所以很奇怪是什么，真想再拿去测序了。谢谢高手了。
请管理员为回答该帖的前5位朋友加一个金币，谢谢。我自己不懂怎么设置。
[search]TAIL[/search]
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1楼 2008-04-19 18:16:54
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annwt

木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
TAIL——PCR是一个很好的方法，可是，他的程序中有一步25度缓慢升温，这样就会有很多非特异条代，25度的退火温度太低了，再加上很高的模板浓度，所以，测序错误再所难免。我觉得有时运气和敏锐很重要。要想试验顺利应该好好读读刘的文章，尤其是95年的那一篇。

[ Last edited by annwt on 2008-4-19 at 20:09 ]
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2楼2008-04-19 20:08:34
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yangxiaofei

现在很晕，刘那篇文章毕竟是成功的典范，我觉得还有很多东西都得靠自己来摸，所以向大家请教下这些问题该怎么解决。
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3楼2008-04-20 13:06:02
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annwt

木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):积极交流奖
由于TAIL－PCR的温度比较低什么引物都可以接合上去，我的建议，
1，3个特异引物的温度应该越来越高，这样可以提高特异性。
2，试验设计的在一天内完成，操作时应该混样，电泳及时跑。
3，个人认为关键是筛选AD引物，样品应该10个到20个。
最后一点，着重分析如何克隆得到启动子，其他的问题先搁置争议，我想这也是老板的意思。

[ Last edited by annwt on 2008-4-20 at 18:57 ]
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4楼2008-04-20 18:40:16
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zhjcao

木虫 (小有名气)
麻烦问一下，你的marker用的是哪个公司的呀？什么型号，很好的。

[ Last edited by zhjcao on 2008-4-20 at 20:46 ]
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5楼2008-04-20 20:45:34
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yangxiaofei

谢谢annwt

谢谢，建议都是我所没听过的，我会试下，Thank you very much
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6楼2008-04-23 10:01:02
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yangxiaofei

回复zhjcao

天根的D2000
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7楼2008-04-23 10:02:09
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