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yangxiaofei

[交流] Tail-PCR结果,请高手分析下

我做了一个克隆启动子的Tail-PCR,SP1,SP2,SP3退火温度为63,59,59第一轮62.8,64.7度,第二三轮58.7度时P到了相同的带,附件1的第18,19为62.8,58.7度的第二三轮产物带,附件2的7,8为64.7,58.7度的第二三轮带,我拿其中的第三轮带测序得到的是SP3 P出的带,而AD没有结合上去,我现在确定第二轮的带肯定不是AD P出的,已经验证过了。我很奇怪的是第二轮的带是什么?如果是SP2和SP2的产物,那它和第三轮的带长度为什么那么相同?若是AD和SP2的产物,第三轮也该能结合上去。所以很奇怪是什么,真想再拿去测序了。谢谢高手了。
请管理员为回答该帖的前5位朋友加一个金币,谢谢。我自己不懂怎么设置。
[search]TAIL[/search]
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annwt

木虫 (正式写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
TAIL——PCR是一个很好的方法,可是,他的程序中有一步25度缓慢升温,这样就会有很多非特异条代,25度的退火温度太低了,再加上很高的模板浓度,所以,测序错误再所难免。我觉得有时运气和敏锐很重要。要想试验顺利应该好好读读刘的文章,尤其是95年的那一篇。

[ Last edited by annwt on 2008-4-19 at 20:09 ]
2楼2008-04-19 20:08:34
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yangxiaofei

现在很晕,刘那篇文章毕竟是成功的典范,我觉得还有很多东西都得靠自己来摸,所以向大家请教下这些问题该怎么解决。
3楼2008-04-20 13:06:02
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annwt

木虫 (正式写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):积极交流奖
由于TAIL-PCR的温度比较低什么引物都可以接合上去,我的建议,
1,3个特异引物的温度应该越来越高,这样可以提高特异性。
2,试验设计的在一天内完成,操作时应该混样,电泳及时跑。
3,个人认为关键是筛选AD引物,样品应该10个到20个。
最后一点,着重分析如何克隆得到启动子,其他的问题先搁置争议,我想这也是老板的意思。

[ Last edited by annwt on 2008-4-20 at 18:57 ]
4楼2008-04-20 18:40:16
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zhjcao

木虫 (小有名气)

麻烦问一下,你的marker用的是哪个公司的呀?什么型号,很好的。

[ Last edited by zhjcao on 2008-4-20 at 20:46 ]
5楼2008-04-20 20:45:34
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yangxiaofei

谢谢annwt

谢谢,建议都是我所没听过的,我会试下,Thank you very much
6楼2008-04-23 10:01:02
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yangxiaofei

回复zhjcao

天根的D2000
7楼2008-04-23 10:02:09
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