至尊木虫 (知名作家)
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【答案】应助回帖
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三叶草王: 金币+25, 翻译EPI+1, ★★★★★最佳答案 2014-08-28 09:57:43
刚才忘了删掉部分原文，以下文为准：
1. 采用Lipofectamine 2000 （Invitrogen,Carlsbad, CA, USA）转染hsa-miR-29a、 -29b-1、-29c（模拟物）以及阴性对照 (Ambion, Austin, TX, USA) ，浓度为100 nM。在A549和H1299细胞中利用慢病毒载体shRNA系统（含有嘌呤霉素筛选标记）（Santa Cruz Biotechnology，Dallas, Texas, USA）稳定转染方法敲减DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达。根据生产商说明书利用WIF-1 shRNA Plasmid (Santa Cruz)瞬时敲减WIF-1（的表达）。去甲基化实验时，用10 μM 5-Aza （Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA) 处理72小时。
2 . 甲基化特异性PCR (MSP)
用DNA Maxi Kit(Qiagen, Valencia, CA)提取基因组DNA，并用MethylCode™ Bisulfite Conversion Kit （Invitrogen）根据生产商使用手册进行亚硫酸氢钠进行修饰。根据以前的报告[7]设计WIF-1甲基化特异性引物和非甲基化特异引物（MSP或USP）(表1)。MiR-29s从两个不同染色体上转录成两个主要转录产物（miR-29b1和miR-29a在染色体7q32; miR-29b2和miR-29c在染色体1q32）。MSP和USP用MethPrimer程序设计 (https://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer)。miR-29b1引物和miR-29a引物分别对应于启动子区域顺序1112到1085、及993到971 (表1)。miR-29b2引物和miR-29c引物分别对应于启动子顺序的1339至1314和1178至1153(表1)。
3. 细胞增殖实验
肿瘤细胞转染microRNA模拟物和/或WIF-1 shRNA。转染后72小时，细胞种植于96孔板（5000细胞/孔），并于37度培养。每天计数活细胞数量。每孔加入10 μl 5 mg/ml的MTT并继续培养4小时。所形成的沉淀溶于100 μl而家亚砜，并用ELISA酶标仪 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)检测562 nm的光吸收度。每一实验设三个平行实验，同样的实验重复三次。
4. 凋亡检测
细胞种植于6孔板中，密度为每孔1百万细胞，用microRNA模拟物和/或WIF-1 shRNA转染。转染后72小时，再次悬浮细胞并用FITC交联的抗膜联蛋白V抗体和碘化丙啶（PI）对细胞染色，染色采用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒 (Sigma–Aldrich)进行。用FACSCalibur流式细胞仪 (Becton Dickinson, USA)对染色细胞进行定量。
5. 用Student’s t检验或Mann–Whitney’s U检验对两组间的差异进行统计学分析。用Pearson’s的相关检验进行相关分析。通过单因素方差分析进行多组间方差分析。数据用均数±标准差(SD)表示，视p< 0.05为有显著统计学意义。 |
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