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求助癌细胞糖蛋白如何提取？如何提取不同细胞器的糖蛋白？有没有相关的参考文献求链接。谢谢！ [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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凌波丽
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我建议楼主在设计分离提纯目的蛋白质的实验流程时，先把目的蛋白质自身的理化性质弄清楚，然后根据目的蛋白质的理化性质来分离提纯蛋白质，分析蛋白质的理化性质的方法，至少蛋白质的pI和相对分子量应该知道吧，不然有什么依据来作分离提纯哪？ 下文分为三个部分： 一、蛋白质分离提纯前的准备工作（包括生物信息学工作和基因表达工作） 1.确定蛋白质的具体来源。 （1）确定要分离的蛋白质的细胞来源和组织来源。先培养细胞和分离细胞和组织成分。分离细胞用流式细胞仪很容易，尤其是把肿瘤细胞从非肿瘤细胞和肿瘤细胞的群体中中分离出来，参考： MMB 263-Flow Cytometry Protocols 2E（with contents） http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7637366 。 （2）确定目的蛋白质的亚细胞定位。不知道亚细胞定位，可以从数据库自己查一下，或者用生物分子功能的预测软件加以预测。 参考：D. J. Rigden Edits, From Protein Structure to Function with Bioinformatics(2009) http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6382178 如果是真核细胞，则一般应该确定蛋白质在细胞中的哪个细胞器或者细胞空间富集，然后在粗分离时现在粉碎细胞后，分离相关的细胞器（细胞裂解液中留下需要的有型的各种细胞器），或者细胞介质（细胞裂解液中去掉有型的各种细胞器），一般粉碎细胞后可以用离心的方法加以实现。 2.确定蛋白质的pI。首先要使用生物信息学方法，比如用DNAStar中的Protean，打开或者重建一个蛋白质的氨基酸序列文件，然后选择analysis----->Titration Curve，分析其滴定曲线与等电点，显示出的曲线图为：横坐标为蛋白质的净电荷数，纵坐标为pH，会自动标出pI值。 3.确定目的蛋白质的亲水性和疏水性的大概的氨基酸残基的分布区域（这个操作不是必须的）。目的蛋白质的亲水性和疏水性的大概的氨基酸残基的分布区域预测，即预测蛋白质的序列中的可能存在的典型的亲水性区域和疏水性区域的氨基酸残基，有助于分析蛋白质序列的抗原表位。可以用BioEdit，启动BioEdit，选择File--->Open，再点击New Alignment,再选择Sequence ---->New Sequence，在窗口出现的地方选择序列的类型为protein，然后贴上蛋白质序列，然后扫一下序列，选择Sequence------>Protein ---->Kyte & Doolittle Mean Hydrophobicity Profile，在出现的窗口中点击Run Plot,会得到横坐标为氨基酸位点，总坐标为 Mean Hydrophobicity Profile 的坐标曲线图。另外，利用DNAstar的Protean也可以得到Hydrophobicity Profile，打开或者重建一个蛋白质的氨基酸序列文件，选择analysis----->Show Available Methods，显示出More Methods，其中有Hydropathy-Kyte-Doolittle，其下面有：Hydrophobicity Plot，Hydrophobic Regions，Hydrophilicity Plot，Hydrophilic Regions 四种分类和相应的图标，根据操作界面的提示展开Hydropathy后会得到一个Hydrophobicity Plot，Hydrophobic Regions，Hydrophilicity Plot，Hydrophilic Regions 四种分类和相应的图标构成直线图，上面会显示出各个氨基酸的疏水和亲水性。 4.确定目的蛋白质的相对分子量。最简单的方法用质谱直接测定目的蛋白质的相对分子量。如果根本没有目的蛋白质，那么就用110X目的蛋白质的氨基酸残基总数。也可以用110X目的蛋白质的氨基酸残基总数后，再用SDS PAGE总可以测定出来目的蛋白质的较为精确的分子量，如果几条带比较接近，分别回收后测序即可确定哪一条带是目的蛋白质，实际上一般只需要对N末端测定大概15个左右的氨基酸残基就能确定了，当然，这步的前提是要大致提取出来目的蛋白质。用软件可以精确地计算出蛋白质的分子量，可以用ANTHEPROT，启动后进入antheprot Editor 窗口，把待测定的蛋白质的氨基酸序列文件拷贝进去即可，菜单上有很多的选项，根据需要，点击按键，比如Methods ,选择分子量，滴定曲线等，会得到相对分子量，PI等信息。这一步是必须的。 5.预测目的蛋白质的可能的空间三维形态。直接预测三级结构即可，这步对于分离提纯这一步不是必须的。 6.预测目的蛋白质的可能的相互作用的蛋白质。这一步也不是必须的，因为你可以直接制备单克隆抗体。 7.如果上游的基因表达部分的蛋白质的表达量是在太小，首先是要加大目的蛋白质的表达量，不然下游再如何努力也没有用。如果楼主一点要在很低浓度的目的蛋白质环境中提取和富集目的蛋白质，那么最好的一种方法是Protein equaliser technology，一种组合化学实验技术，原理上也亲和层析差不多，当然效率要高的多。 预测蛋白质的可能的空间三维形态和预测蛋白质的可能的相互作用的蛋白质的生物信息学方法请见： 确定蛋白质—多肽相互作用结合位点的实验设计：凌波丽个人总结之二 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6739957&fpage=1&target=blank 上面附有参考文献预测三级结构的相关网站。 8.如果根本就没有办法获得目的蛋白质，而且这样的蛋白质还是全新的，也就是根本分离不到目的蛋白质，就别想拿到抗原，连WB也做不成，更别说亲合层析。那么怎么办？ 一种方法通过生物信息学方法预测蛋白质的可能的相互作用的蛋白质，找出其受体或者与其有亲和性的蛋白质，作为亲和层析的配体，这就是有病！还可以通过表位的生物信息学预测，查找与其表位类似的其他蛋白质，用后者制备出多克隆抗原，作为亲合介质，然后对目的蛋白质进行亲和层析，这就是更加有病！最简单的办法没有亲和片段，自己接上去一段就是，就用His6标签，而且His6标签得基因与目的蛋白质的基因之间构建凝血酶位点，因为便于后期切除标签，用镍柱亲和层析，这在什么情况下都可以用。 二、蛋白质的分离提纯的一般顺序（这部分借鉴了我的一位朋友的工作笔记，并得到其许可使用和进行编辑修改）。 蛋白质的分离提纯由于不同的蛋白质的彼此差异较大，就普遍而言可能没有特定的分离纯化的固定顺序，不过仍然有一些可以参考的大致的分离纯化流程。因为我的实验工作是与重组蛋白质相关，所以就在这里讨论重组蛋白分离纯化的可作参考的大致的分离纯化流程。一般来说，重组蛋白质的分离纯化比天然蛋白质要容易一些。 一般蛋白质的分离纯化的一般顺序是：粉碎细胞或提取含有提取分泌到细胞外的表达产物的培养基、沉淀、过滤、初步浓缩（比如超滤）、中间纯化操作、最后采用高分辨率的纯化方法进行分离纯化、产物鉴定和保存。 第一步，粗分离。粉碎细胞或提取含有提取分泌到细胞外的表达产物的培养基、沉淀、过滤、初步浓缩（比如超滤）一般也叫粗分离。与天然蛋白质的分离纯化相比，重组蛋白质的分离纯化可以不用先去确定足量表达目的蛋白质的组织与细胞，并且先对这些组织和细胞进行分离和富集，另外由于大肠杆菌表达系统的广泛使用，重组蛋白质往往在大肠杆菌细胞中形成包涵体，如果不用分泌表达的话，这样粉碎了大肠杆菌细胞后只要过滤就可以获得固体的包涵体颗粒。即使要使用酵母细胞、动物细胞和植物细胞表达重组蛋白也往往需要先在大肠杆菌细胞等原核细胞中进行试表达。 如果不形成包涵体时，使蛋白质发生沉淀可使用、丙酮、硫酸铵、聚乙烯亚酰胺等化学试剂或者调节溶液的pH值至目的蛋白质的等电点获得沉淀并经过过滤而取出，然后在对沉淀物进行溶解，如果是耐高温的目的蛋白质可以通过加热使得其他蛋白质变性后沉淀，然后提取和保留上清液，上清液里即含有目的蛋白质。聚乙二醇对于浓缩非包涵体蛋白质是一种有效的试验方法，而且聚乙二醇很少使得蛋白质变性，真的变性了之后加入水溶解浓缩的蛋白质样品液，然后用适当孔径的超滤离心管除去聚乙二醇即可。 包涵体经过离心、沉淀、过滤获得后，也必须使得包涵体溶解，否则后面的分离提纯工作就无法进行了。 不易溶解于水的蛋白质可使用去垢剂或表面活性剂增溶 以便达到蛋白质溶解于水的目的，但是不要使用超声波把浑浊的蛋白质溶液“绞”成清亮状态，因为超声波的能量足以打断共价键，使得肽链断裂。不幸的是：一些实验操作者对于超声波发生器似乎有过于强烈的实验需求，可能是因为操作省事，反正强度适当且时间足够，开动超声波发生器肯定是能把浑浊的蛋白质溶液“绞”成清亮状态，超声波连带有肽聚糖细胞壁的大肠杆菌细胞都能粉碎，何况溶液中的蛋白质。简而言之，利用蛋白质的溶解度和抗热性与抗蛋白酶解等特殊性质分离出蛋白质一般是在第一步的粗分离阶段，而不在中间纯化和精细分离这两个步骤进行，粗分离过程也利用蛋白质的密度、分子量大小和形状的特性，蛋白质的后三种性质在后面的中间纯化和精细分离同样会利用到。利用蛋白质的溶解度与抗蛋白酶解等特殊性质有时候在蛋白质产物的质量检测阶段也可能用到。粗分离阶段已经能够去掉相当多的DNA、多糖、脂类、热源、病毒等非蛋白质的杂质成分，但是以后的分离纯化蛋白质的技术环节仍然必须考虑到去除非蛋白质的杂质成分。 第二步，中间纯化。中间纯化阶段一般是利用蛋白质的分子量、形状、电荷性质、等电点、疏水性、密度、与配体的结合能力、与金属的结合能力、与有机小分子（比如某些、染料分子）的结合能力等特性进行蛋白质产物的分离提纯。中间纯化的实验操作普遍地包括各种层析方法，比如离子交换层析、疏水层析、亲和层析、金属螯合层析、等电点聚焦、凝胶过滤层析等，也包括离心、透析、超滤等其他操作穿插其间，不过一般没有电泳，特别是在大规模分离提纯蛋白质时。SDS PAGE电泳一般不能用于分离提纯蛋白质，只能用于检测蛋白质，因为SDS PAGE电泳时，样品会100度水浴变性，而后加上足量的SDS，SDS变性蛋白质可能在除去SDS后使得蛋白质复性，但是热变性的蛋白质，在目前的条件下很难复性，除非后面是用质谱或者串联质谱进行检测，或者是进行WB检测，否则SDS PAGE电泳回收的目的蛋白质已经没有什么用处了。 各种层析方法，比如离子交换层析、疏水层析、亲和层析、等电点聚焦、凝胶过滤层析、金属螯合层析等在中间分离纯化阶段没有完全固定的顺序，虽然一般处理比较大量的样品时，离子交换层析、疏水层析一般先使用，但是有时在凝胶层析之后也可能会用到离子交换层析、疏水层析，比较普遍的情况而言，亲和层析、金属螯合层析不会首先在中间分离阶段的初始时期及使用。至少在我的工作经验，电泳从来没有用于过中间分离阶段，电泳是用于蛋白质的纯度检验阶段，当然不是唯一检测纯度的手段。中间纯化步骤比较多的是首先使用离子交换层析和疏水层析，而后根据具体情况，可使用等电点聚焦、凝胶过滤层析等其他的层析方法，离心、透析、超滤等其他操作根据需要而穿插其间。再往后可以用亲和层析和金属螯合层析，不要把亲和层析和金属螯合层析一开始就在中间纯化阶段使用，因为样品溶液中的杂质太多，会干扰受体-配体的专一性结合。 第三步是精细分离纯化。精细分离纯化一般是用凝胶过滤层析和HPLC，这样可以依靠蛋白质的分子量的差别得到比较纯的目的蛋白质产物，而且能够去盐和有机小分子（尤其是在亲和层析和金属螯合层析阶段积累的盐或有机小分子），HPLC过早使用效果不好，杂质过多可能会堵住柱内的填充介质。亲和层析和金属螯合层析一般而言，也不适合作为分离提纯蛋白质工作的最后一步（具体理由会面会讨论）。这三步结束时，一般目的蛋白质样品的浓度会有所降低，而且会有非缓冲溶液的其他的洗脱液，所以有必要用透析、超滤去除小分子和适当浓缩，以利用产物检测和保存。 第四步，产物鉴定。一方面需要检测目的蛋白质的纯度。蛋白质产物的纯度一般可以用SDS-PAGE、蛋白质的溶解度是否均一、HPLC、质谱、生物功能、肽谱分析等检测技术。实际上用红外傅里叶光谱、紫外光谱和圆二色光谱联合检测蛋白质的纯度更容易，而且不会损失样品，即用被检测蛋白质和标准品的有关光谱参数加以对比。另一方面要检测目的蛋白质中的热源、DNA、病毒等非蛋白质成分，特别是对于药用和食用蛋白质，可以用FTIR，MS，被检测的非目的蛋白质的杂质的生物活性检测等。第五步，产物保存。一般而言，如果不是冷敏性的蛋白质可使用冻干机制备为蛋白质干粉状制剂，然后放入0-4摄氏度的冰箱可长期保存，也可将蛋白质放入Eppendorf管，加入适量甘油和缓冲溶液（调节好浓度）后封口并贴上标签，再放入零下70摄氏度冰箱保存。对于冷敏性的蛋白质或者不知低温下是否稳定的蛋白质不能使用低温冻干处理，将蛋白质放入Eppendorf管，加入适量甘油和缓冲溶液（调节好浓度）后封口贴上标签，再放入零下70摄氏度冰箱保存，并且要分批小包装，避免反复冻融。（二、蛋白质的分离提纯的一般顺序部分借鉴了我的一位朋友的工作笔记，并得到其许可使用和进行编辑修改，再往下又是我自己写的了） 三、我对于楼主的目的蛋白质的分离纯化的实验设计的意见 楼主的目的蛋白质只要存在于细胞中，粗分离阶段粉碎细胞后，进行蛋白质的沉淀、超滤、离心处理后，然后只要知道了等电点，用离子交换层析或者疏水层析先处理以便缩小样品体积，根据蛋白质的亲水和疏水状况而定。之后，在知道相对分子量的情况下，用分子筛层析。再往后金属螯合层析或者抗体-抗原亲和层析，至此怎么着都能收获到一些目的蛋白质。最后还可以用HPLC，虽然HPLC不用于制备。楼主的蛋白质既然是癌细胞的糖蛋白质，那么再洗分离时可以使用凝集素亲和层析。另外在粗分离时首先分离癌细胞的你需要的细胞器。 |
2楼2014-08-20 11:49:28
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大鱼大鱼: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2014-08-21 21:42:18
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生物信息学参考书： 1.DNA和蛋白质序列数据分析工具(第二版)PDF http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6358121&fpage=1&target=blank 下载后即可阅读。 2.DNA和蛋白质序列数据分析工具_(第三版） http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7614763&fpage=1&target=blank 下载后好像无法解压，楼主试试看吧，至少“DNA和蛋白质序列数据分析工具(第二版)”肯定能够用。 “DNA和蛋白质序列数据分析工具(第二版)”都是讲的生物信息学数据库和生物信息学软件的具体应用，很容易看懂并且自己上手操作，不过没有讲述各种算法的原理。 如果要更深入学习生物信息学，建议学习： 1.Pierre Baldi etal.,Bioinformatics------the Machine Learning Approach,MIT press,2001,千万不要看该书的翻译版本，翻译版烂的难以想象，翻译版就连条件概率的公式的含义都不知道怎么解释！ 2. 2.M.Zvelebil ,J.O.Baum 著（2008），李亦学、郝沛 主译，理解生物信息学，科学出版社，2012，这本书的英文原版，我还没有见过，此书内容丰富，解析详细，但是让人非常不爽的是全书所有的数据库和软件下载处均未在正文中给出具体网址，而是每章末的参考文献中给出带有具体网址的SCI文献。 3.李霞、李亦学 主编，生物信息学学习指导与习题集，人民卫生出版社，2011，现在大陆唯一的一本生物信息学习题解答，包括上机题目中不少也有文字版本的具体解答。 4.M.Michael Gromiha,Protein Bioinformatics:From Sequence to Function,Elsevier,2001. 其他的参考文献请自行搜索。 |
3楼2014-08-20 11:51:05
4楼2014-08-21 21:41:44
