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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
sophia-yxh: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-08-11 19:10:17
可能是因为WB所用抗体效价需要稍微高一点,另外,你用的是什么转膜方法,包被用的什么,包被时间多少呢,并且PBST洗涤过程都会影响结果的。
51楼2014-08-11 13:50:29
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sophia-yxh

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
51楼: Originally posted by snoopytbw at 2014-08-11 13:50:29
可能是因为WB所用抗体效价需要稍微高一点,另外,你用的是什么转膜方法,包被用的什么,包被时间多少呢,并且PBST洗涤过程都会影响结果的。

包被抗体是别的公司做的,一般都是包被时间在6小时以上,Pbst洗膜时间是10Min每次,洗三次 ,一抗也是那家做的,用Hrp标记的,以前出现过不好的结果,是因为包被抗体出了问题,后来我们找到原因,那个包被抗体就没有用了,
上周做elisa连标曲都没有做好,没有线性,低浓度和高浓度读数差不多,而且,样品的结果和电泳结果完全相反,不知道是哪里出问题了

[ 发自小木虫客户端 ]
我是来学习的!!
52楼2014-08-11 17:22:05
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

引用回帖:
52楼: Originally posted by sophia-yxh at 2014-08-11 17:22:05
包被抗体是别的公司做的,一般都是包被时间在6小时以上,Pbst洗膜时间是10Min每次,洗三次 ,一抗也是那家做的,用Hrp标记的,以前出现过不好的结果,是因为包被抗体出了问题,后来我们找到原因,那个包被抗体就没 ...

一抗包被一般4度过夜(回收),二抗一般是2小时,另外PBST洗涤的话,最好是洗20分钟,5-6次。(做预实验,有的抗体结合力强,需要多洗几遍,有的结合力弱,少洗几次。)
另外,ELISA每次包被也需要做严格洗涤,否则容易出现假阳性。建议ELISA多洗几次,WB二抗也多洗几次,但一抗建议多包被些时间。我们做过对比,4°过夜比37度2小时效果好很多。
53楼2014-08-12 11:24:05
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skyswimer

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小冀-: 金币+5, 应助指数+1, 鼓励新虫友回帖交流 2017-03-09 11:11:32
您说的第二条应该是您实验出现问题的原因。原核和真核表达的蛋白修饰和构象会产生差别,虽然WB检测的是变性蛋白,也不排除抗体识别点存在差异,或者差异引起抗体识别能力降低。您使用的显色方法灵敏度偏低,换成高灵敏的显色方法可能会出现结果,但不能改善抗体结合力低的问题。
54楼2017-03-09 10:33:16
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