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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » WB和elisa结果不一致
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
sophia-yxh: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-08-11 19:10:17
可能是因为WB所用抗体效价需要稍微高一点，另外，你用的是什么转膜方法，包被用的什么，包被时间多少呢，并且PBST洗涤过程都会影响结果的。
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51楼2014-08-11 13:50:29
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sophia-yxh

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
51楼: Originally posted by snoopytbw at 2014-08-11 13:50:29
可能是因为WB所用抗体效价需要稍微高一点，另外，你用的是什么转膜方法，包被用的什么，包被时间多少呢，并且PBST洗涤过程都会影响结果的。

包被抗体是别的公司做的，一般都是包被时间在6小时以上，Pbst洗膜时间是10Min每次，洗三次 ，一抗也是那家做的，用Hrp标记的，以前出现过不好的结果，是因为包被抗体出了问题，后来我们找到原因，那个包被抗体就没有用了，
上周做elisa连标曲都没有做好，没有线性，低浓度和高浓度读数差不多，而且，样品的结果和电泳结果完全相反，不知道是哪里出问题了

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我是来学习的！！
52楼2014-08-11 17:22:05
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)
引用回帖:
52楼: Originally posted by sophia-yxh at 2014-08-11 17:22:05
包被抗体是别的公司做的，一般都是包被时间在6小时以上，Pbst洗膜时间是10Min每次，洗三次 ，一抗也是那家做的，用Hrp标记的，以前出现过不好的结果，是因为包被抗体出了问题，后来我们找到原因，那个包被抗体就没 ...

一抗包被一般4度过夜（回收），二抗一般是2小时，另外PBST洗涤的话，最好是洗20分钟，5-6次。（做预实验，有的抗体结合力强，需要多洗几遍，有的结合力弱，少洗几次。）
另外，ELISA每次包被也需要做严格洗涤，否则容易出现假阳性。建议ELISA多洗几次，WB二抗也多洗几次，但一抗建议多包被些时间。我们做过对比，4°过夜比37度2小时效果好很多。
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53楼2014-08-12 11:24:05
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skyswimer

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小冀-: 金币+5, 应助指数+1, 鼓励新虫友回帖交流 2017-03-09 11:11:32
您说的第二条应该是您实验出现问题的原因。原核和真核表达的蛋白修饰和构象会产生差别，虽然WB检测的是变性蛋白，也不排除抗体识别点存在差异，或者差异引起抗体识别能力降低。您使用的显色方法灵敏度偏低，换成高灵敏的显色方法可能会出现结果，但不能改善抗体结合力低的问题。
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54楼2017-03-09 10:33:16
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