24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

sophia-yxh

铜虫 (正式写手)

应助: 3 (幼儿园)
金币: 329.2
散金: 488
红花: 10
帖子: 528
在线: 245.2小时
虫号: 1358919
注册: 2011-08-02
性别: MM
专业: 药理学其他科学问题

[求助] WB和elisa结果不一致已有3人参与

目前本人一直在做IFN的融合蛋白，是通过酵母分泌表达所得；以前是用大肠杆菌包涵体表达的，通过复性获得样品，该样品通过ELISA\WB检测，以IFN抗体检测的，均为阳性结果，且做抗病毒实验，其抗病毒活性也和市场销售的IFN在同一个数量级，但是不能达到我们的目标要求，所以选择真核酵母分泌表达，想获得IFN和另一个蛋白A的双重作用；

酵母表达的IFN融合蛋白通过ELISA检测是为阳性的，也是用IFN抗体的，我们是自己包板的；但是WB检测却总是阴性的，我们同时以以前原核表达的作为对照，对照每次WB的结果都很稳定是阳性的，但是酵母分泌表达的却很难做出阳性的，虽然也做出来1-2次，我现在由以下几点担心：
1.IFN从融合蛋白上脱落了；
2. IFN上有一个糖基化位点，是不是在真核中糖基化了，恰好遮住了抗体识别位点；
3.我是通过DAB显色的，是不是显色方式不正确；

请大家帮我讨论讨论，谢谢

回复此楼

» 猜你喜欢

最近几年招的学生写论文不引自己组发的文章已经有5人回复
职称评审没过，求安慰已经有54人回复
26申博自荐已经有3人回复
A期刊撤稿已经有4人回复

我是来学习的！！

1楼 2014-08-08 12:57:26

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

MicEPI: 6
应助: 261 (大学生)
贵宾: 0.014
金币: 5985.4
散金: 3
红花: 71
帖子: 1633
在线: 265小时
虫号: 3361216
注册: 2014-08-11
性别: MM
专业: 环境微生物学
管辖: 微生物

引用回帖:

52楼: Originally posted by sophia-yxh at 2014-08-11 17:22:05
包被抗体是别的公司做的，一般都是包被时间在6小时以上，Pbst洗膜时间是10Min每次，洗三次，一抗也是那家做的，用Hrp标记的，以前出现过不好的结果，是因为包被抗体出了问题，后来我们找到原因，那个包被抗体就没 ...

一抗包被一般4度过夜（回收），二抗一般是2小时，另外PBST洗涤的话，最好是洗20分钟，5-6次。（做预实验，有的抗体结合力强，需要多洗几遍，有的结合力弱，少洗几次。）
另外，ELISA每次包被也需要做严格洗涤，否则容易出现假阳性。建议ELISA多洗几次，WB二抗也多洗几次，但一抗建议多包被些时间。我们做过对比，4°过夜比37度2小时效果好很多。