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xiaoxiao198439银虫 (小有名气)
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[求助]
有关DNA测序
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哪位师兄师姐能系统的介绍一下当前最新的DNA测序技术,什么454，solexa, solid之类的原理以及他们的区别？谢谢！ Sample Text |
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2楼2008-04-09 17:27:59
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了解特定疾病过程中甲基化状态的重要性极大地促进了精确描述和量化 DNA 甲基化的实验方法的发展。一些常规的甲基化检测方法，如DNA 测序，以及 其它基于凝胶和PCR 技术的甲基化检测方法，都是费时费力，不适于进行大样 本实验。 而最近有些的报道表明利用DHPLC 技术进行甲基化检测可以避免重蹈其它方法 的覆辙[26，27，28，29，30]。 Deng 在他的文章[26]中介绍了一种PCR 扩增亚硫酸盐修饰的CpG 岛，然 后利用DHPLC 技术同时检测扩增产物中的CpG 岛甲基化和SNP 的方法，并用这 种方法对多种细胞系和胃癌细胞系中hMLH1 启动子，以及环氧化酶2（COX2） 启动子的甲基化状态进行了检测[26]。这种亚硫酸盐-DHPLC 技术可对纯合与杂合 样本中的同源与异源CpG 岛结构进行快速的甲基化和SNP 检测和定量。这种方 法的另一个优点是在扩增片段中同时检测出CpG 位点和SNP。两项相似的实验 都使用甲基化特异性PCR 和DHPLC 技术来分析三种人类印记基因的甲基化状态， 这三种基因分别是：AS 和PWS 相关的SNRPN 基因，以及BWS 相关的LIT1 和H19 基因[27，28]。利用这项技术可以在患有PWS 婴儿的样品中检测到低水平的细 胞镶嵌现象，这充分证明了该项技术的敏感性[27]。这种变异水平很低的细胞 系（血中低于8%） 用传统的分子生物学方法根本无法检测到。而这种检测低水平细胞镶嵌的能力 对于以遗传镶嵌作为部分显型表现的各种孟德尔和非孟德尔式遗传疾病的临床 诊断和预后有着重要的意义[15]。 另外一种基于DHPLC 技术的方法也被用来检测特定位点的CpG 岛甲基化 [29，30]。这种方法利用亚硫酸盐处理的基因组DNA 的PCR 产物，将单核苷酸 引物延伸与DHPLC 分离技术相结合，来区分甲基化和非甲基化的CpG 岛。而有 些CpG 位点是在对引物延伸产物进行多链化之后再进行分析的。利用DHPLC 技 术可对特定CpG 位点的甲基化进行量化分析。而对于已经明确甲基化对基因调 控影响的特定序列，使用DHPLC 技术对其进行分析是非常合适的。 DHPLC 在SNP 发现和确定研究中的应用 候选基因筛查 人类基因组中众多的DNA 多态性以及SNP 对基因功能的影响决定了深入 了解候选效应蛋白的遗传变异状况是非常必要的。在构建一个候选疾病基因的 遗传变异图谱时，首先用经典方法确定一个低分辨率的遗传位点，接下来再根 据参照样品（野生型）和各种受检样品建立一个高分辨率的SNP 图谱[31]。为 了实现上述目标应该在目的基因区域确定SNP 的位置和类型，这需要PCR 扩增 基因组DNA,并进行测序分析。但是SNP 的实质只是对功能相关研究很重要， 而并非是构建遗传图谱的关键。DHPLC 突变筛查技术很好地适应了遗传变异研 究的这一特点，它只检测DNA 序列差异，并不确定差异的实质。 利用DHPLC-SNP 筛查技术来确定一个功能基因可以采取两种途径[32]。 第一种方法，收集大量的候选疾病基因的样品，然后利用DHPLC 对可能发生 功能性SNP 的编码序列进行筛查。这种方法的前提是与一种遗传病表现型相关 的基因中应有一个或多个疾病相关的突变位点，因此致病基因突变也应相对频 繁地出现在有相应的疾病表现型的样品中。而上述方法对筛查序列的限制也会 导致漏筛位于非编码调节区域的序列变异。在第二种相对全面的方法中，一个 基因的全基因组序列被系统地进行突变筛查。这样做的优点是在样本量充足的 情况下，漏筛功能性多态的几率较小。上述两种基于DHPLC 的方法都能极大 程度上降低SNP 筛查的工作量，进而对人类疾病相关遗传位点的构图产生重要 的影响。下面将简要介绍几篇利用DHPLC 技术进行SNP 筛查的文献报道。 充血性心衰 Lynch和他的同事们在文章[33]中表示充血性心衰（CHF）相关的G 蛋白和 下游信号传导通路蛋白的遗传变异信息存在极大的缺陷。在这项研究中，他们 检测了编码信号传导蛋白的基因，以确定新发现的和已报道的SNP 的发生频率。 通过DHPLC 和确证性双链DNA测序的方法，他们筛查了96-144 个CHF 病人 的9 个主要信号传导基因的56 个编码外显子，并且发现了17 个新的和8 个报 道过的同义SNP, 以及一个新的非同义SNP。由于对NCBI和Celera 数据库最 初的实验中漏筛了多个SNP 很感兴趣，他们又检测了10 个已报道过的非同义 SNP，结果在74-91 个CHF 病人样品中并未发现这些SNP。他们将实验结果与 NCBI 和Celera 的数据进行比较，发现数据库中56%的SNP 并未在他们的样品 中发现，而实验中发现的SNP 中的69%并不存在于数据库中。这项研究表明绝 对性地将现有数据库作为多态标记的来源，并只使用这些标记物会导致错误的 实验结果。另外一项最新的研究[34]表明SNP 数据库中关于25 个G 蛋白耦连受 体的数据只有32%能在样本量为60 的实验中被确证。这说明利用DHPLC 对现 有数据库中的SNP 数据进行确证是一种在更大规模实验前对标志物进行评估的 可靠方法。 神经精神疾病 基因编码区的SNP 可被用来做关联实验，以确定复杂疾病的遗传基础[35， 36]。而这种实验的成功与否极大程度上取决于疾病相关等位基因的频率以及它 们在不同种族人群中的分布[37]。如果待测序列的高危等位基因频率很低，那么 直接确定突变序列基因型的方法就不适用了。以往对基因的分析表明大多数基 因突变频率很低（<0.05），而且低于75 的样本量也会限制检测稀少等位基因的 能力[38]。最近有文献[39]介绍了一项研究，利用DHPLC 对神经精神疾病相关 的两个基因的编码区和剪接结合部的突变序列（频率很低）进行大样本量筛查 （n=450）。结果表明这两种基因，SLC6A4（编码5-羟色胺转运蛋白）和SLC18A2 （编码血管单胺转运蛋白），在等位基因变异的数目和频率方面存在明显的差 异。如果将这样的变异基因比较扩展到更大范围的基因中去，那么就有可能确 定特定形式的遗传变异与基因功能之间的关联。 阿尔茨海默病 阿尔茨海默病(AD)是一种渐进性神经退行性病变，它是由复杂的遗传和环 境因素共同造成的。一项成功的SNP 研究确定载脂蛋白E（APOE）基因（等 位基因4）是一个易感性位点，可能增大迟发性阿尔茨海默病（LOAD）的发病 几率[40]。到目前为止，这是唯一的被证实的LOAD 易感性标志。一项最近的 研究对位于12 号染色体的编码氧化低密度脂蛋白（LDL）受体1（OLR1）的基 因进行分析[41]。研究者利用DHPLC 对50 名AD 患者的全部OLR1 外显子和 内含子/外显子交界部位进行了突变序列筛查。结果有三种新的遗传变异被鉴别 出来，它们全部位于非编码区域。在对超过800 个LOAD 病例的基因型分析表 明上述的SNP 与AD 之间存在明显的关联，其中最重要的是位于非APOE4 区 域的3’-UTR SNP。关于遗传变异对早发性阿尔茨海默病（EOAD）和LOAD 已 有大量报道（ 见阿尔茨海默病突变数据库 https://molgen-www.uia.ac.be/ADMutations/）。 例如编码淀粉样前体蛋白的基因（APP）和编码早老素的基因（PSEN1, PSEN2） 发生突变会通过改变γ-分泌酶活性一起少见的早发性阿尔茨海默病（EOAD）。 近来一种名为nicastrin(NCSTN)的跨膜糖蛋白被确定是γ-分泌酶复合物的一部 分，而后者可切割淀粉样前体蛋白（APP）[42]。NCSTN 被定位于1q23，一个 与LOAD 相关的区域。近来有一项研究利用DHPLC 对两名荷兰的EOAD 或 LOAD 患者进行了NCSTN 基因突变检测[43]。结果在NCSTN 基因中发现了14 种新的SNP，其中之一可能能增大EOAD 的发病几率。 心脏病 近来有大量的研究通过对突变序列的鉴别研究各种心脏疾病的相关基因。 家族性肥大性心肌病（HCM）是一种常见的常染色体遗传病，病变部位为心肌 小节。在9 种编码肌小节蛋白的基因中发现的突变已经证明与HCM 相关[44]。 最常见的突变基因是编码β-肌球蛋白重链的MYH7 基因，而功能相关性突变发 生在编码区域的5’端部分。近来有研究利用DHPLC 技术来筛查MYH7 基因编 码酶解肌球蛋白轻链(LMM)的编码区3’端部分。结果研究者发现了破坏MYH7 基因功能的突变[45]，这说明只有进行全基因突变筛查才能保证正确的诊断。另 外超过1/3 的HCM 病例没有发现任何突变，无论是在已知的肌小节基因，还是 在与心脏能量稳态相关的其他基因中，结果都一样。利用DHPLC 技术对重症 HCM 家系的编码AMP依赖蛋白激酶的γ2 亚基的PRKAG2 基因进行的突变筛 查证明能量耗竭是心肌功能失常的主要成因[46]。近来对HCM 致病基因的遗传 异质性的深入研究[44，47]表明扩大对HCM 的遗传检测是非常有必要的。 近来还有许多关于其他心肌疾病的候选基因筛查研究。如对位于1q42-q43 的一些疾病相关基因进行DHPLC 突变筛查[48]。结果在一个患有致心律失常性 右心室心肌病2（ARVD2）的家系中发现了一种编码心脏ryanodine 受体(RYR2) 的基因突变。这些突变的识别为进行症前诊断提供了一个标志物，也为早期监 测和治疗干预提供了机会。这些发现也有可能促成更特异有效的药物干预。 自身免疫病和炎症 另一个焦点研究领域是筛查自身免疫病和炎症相关的基因突变。利用 DHPLC 技术，研究者已识别出了多种致病基因突变如PAPA 综合征（脓性无菌 性关节炎，坏疽性脓皮病和粉刺），和家族性复发性关节炎（FRA）（一种主要 影响皮肤和关节组织的早发性遗传病）的致病基因突变 [49]。而研究者指出这 些突变影响了正常炎症反应的信号传导通路，因此这类自身免疫病有可能与普 通的炎症性疾病如风湿性关节炎，炎性肠病等有相同或相似的病因。利用 DHPLC 技术，研究者也在编码胸腺特异性丝氨酸蛋白酶（PRSS16）的基因中 发现了一些SNP，这些基因变异位于HLA 复合体中，后者包含有多种免疫疾病 的相关基因[50]。这些基因突变中的一部分有生物学作用，有必要深入研究它们 的疾病相关性（如与糖尿病的关联）。 蛋白水解酶和它们的抑制剂在维持免疫系统稳态过程中发挥重要的作用。 因此这些蛋白的突变形式有可能产生显著的生物学后果。利用DHPLC 技术， 研究者在编码丝氨酸蛋白酶抑制物Kazal-5 蛋白（LEKT1）的SPINK5 基因中 发现了一组突变，而这种基因是一种常染色体隐性遗传皮肤病Netherton 综合征 的缺陷基因[51]。LEKT1 是第一个被发现参与免疫疾病的丝氨酸蛋白酶抑制物。 现已发现许多编码与LEKT1 类似的丝氨酸蛋白酶抑制物和激活物的基因突变 与疾病相关，如Kazal-1 胰蛋白酶抑制物与慢性胰腺炎（CP），以及组织蛋白酶 C 与牙周疾病等。 CP 是一种严重时可能危害生命的疾病。在过去的几年中，已有三种基因被 发现与CP 有关，它们是CFTR, PRSS1 和PST1[52]。近来有一项研究利用 DHPLC 技术在39 个病人中对上述三种基因的整个编码区域和剪接结合部位进 行突变状况的筛查[53]。结果表明约30%的受检者至少有一种基因发生一种突 变。但这不包括新发现的不普遍的基因突变，而这些突变中的一些还有可能具 有功能意义。只有三个病人至少有两种基因中发生了突变。这些少见的病例表 明在CP 易感性位点之间存在某种关联。这项研究也提供了一次对一种常见疾病 的不同基因突变的杂合状态进行研究的独特机会。 遗传变异研究在临床治疗中的意义 药物代谢和耐药性 遗传药理学是一种研究基因在个体对药物治疗和环境因素的生物学反应中 所起作用的学科。不同个体对药物反应存在固有的差异，一些常用药物在几种 重要疾病中的作用请见表3[54]。个体对药物的反应直接受个体的基因型和生活 形式的影响。确定个体的基因突变类型无论对科学家或临床医生来说都是一项 艰巨的任务。但是这种研究却可以区别可能与不可能发生药物反应的患者，以 及识别那些可能发生严重反应的高危患者。因此无论从用药的有效性或安全性 来说，对患者进行遗传实验，以预测他对一种特殊药物的反应十分有必要。这 种研究对将带有特定遗传药理学标记的患者分组进行临床实验也有很大的帮 助。 编码细胞色素，甲基转移酶等代谢酶类的基因多态性对药物反应有显著的 影响。这些酶类参与细胞对药物的吸收，分布，降解和清除等活动。因此确定 影响药物代谢的突变等位基因可以帮助临床医生预测患者对治疗的反应。 DPYD 一项介绍DHPLC 技术筛查编码二氢嘧啶脱氢酶（DPD）的基因DYPD 的 报道证明了识别突变等位基因的遗传药理学价值[55]。这种酶可以催化抗癌药物 5-氟尿嘧啶(5-FU)代谢的限速步骤。DPD 缺乏会导致5-FU 用药后的严重毒性， 因此在使用5-FU 进行化疗之前，确定癌症患者的DPD 遗传状态具有重要的价 值。然而DYPD 基因的复杂性和大小（23 个外显子，150-950kbp）使许多研究 者对研究DPD 缺乏的遗传基础望而却步。一项利用DHPLC 技术对上述基因的 筛查研究检测到全部21 个以前有报道的基因突变，并且鉴别出了纯合与杂合基 因型，证明DHPLC 是一种能够准确，敏感，低消耗地检测具有重要临床意义 的基因突变的方法。DHPLC 的所有这些特点对于以复杂基因（如DYPD）突变 筛查为目的的病人或自然人群研究是非常合适的 编码TPMT 的基因 巯基嘌呤S-甲基转移酶（TPMT）是一种位于细胞质，催化巯基嘌呤S-甲 基化的酶类。巯基嘌呤是一种免疫抑制剂，可被用来治疗急性淋巴细胞白血病 以及风湿性关节炎[56]。编码TPMT 的基因多态性对巯基嘌呤的代谢有严重的 影响，目前已有10 种影响表型的突变等位基因被识别出来[57]。一种利用 DHPLC 快速筛查TPMT相关突变的临床检测方法已经形成[58]。在一项相关研 究中，有98 份来自于正在接受或接受过巯基嘌呤治疗的人群的DNA 样品被用 来筛查TPMT突变。通过直接测序证实，DHPLC可以鉴别出样品中全部（100%） 突变等位基因。DHPLC 对TPMT 相关突变的评估是建立在清晰的洗脱结果基 础上的。如果拥有一套参照数据，DHPLC 的洗脱结果可被用来预测序列突变的 类型[59]。可见DHPLC 这种自动技术可被临床实验室用来确定TPMT 等基因 突变的基因型，以及筛查新的突变。 Imatinib 对从事药物研发基础研究的工作者来说，DHPLC 是一种有价值的辅助工具。 例如近来有研究表明在对白血病患者的治疗过程中，BCR-ABL 激酶激活位点的 基因区域的多种突变对酪氨酸激酶抑制剂Imatinib 的耐药性有影响[60]。这项重 要的发现对于确定需要改变治疗策略的耐药性水平有重大意义。Imatinib 的其它 目标以及酪氨酸激酶抑制剂的其它作用对象的耐药性机制可能与上述研究结果 相似。最近有一项研究利用DHPLC 技术对Imatinib 的一个作用对象c-kit 进行 了突变筛查[61]。研究结果显示不同时期的胃肠道基质瘤（GIST）都有c-kit 基 因突变。这些突变在早期良性的胃肠道基质瘤中存在率较高，这说明c-kit 在早 期GIST 发展中起作用。重要的是，这些带有突变的GIST 类型已被加入了 Imatinib 的适用范围中。虽然c-kit 并不是GIST 由良性转向恶性的标志，但它 却是有用的耐药性指标。可见准确而敏感的对酪氨酸激酶基因靶点的突变研究 能够在不存在类似耐药性的新型抗癌药物研发过程中起到辅助的作用。 VEGF 参与血管生成的基因也是目前深入研究的重要药物靶点。人类血管内皮生 长因子（VEGF）由肿瘤细胞分泌，以自分泌的形式作用于内皮细胞。最近有人 对人类结肠直肠癌中VEGF 的基因突变情况进行了研究[62]。结果发现了4 个剪 接结合部变异位点和6 个新的基因突变。这些突变可能在肿瘤-宿主反应的生物 多样性方面具有重要影响，也可能对药物靶点研究很有价值。 上面这些文献报道为识别和确定与发病危险性，药物反应和耐药性相关的 基因变异提供了理论和应用的介绍。而分析标志等位基因（基因型）和临床特 征（表现型）之间的关系对治疗策略的制定有重要的意义。相信在不久的将来， 对临床相关基因突变的准确识别能帮助医务工作者制定针对每个病人的独特治 疗方案，从而提高对疾病的治疗和控制水平。 总之，近几年来，DHPLC 技术飞速发展，利用DHPLC 对大量的疾病相关 基因突变进行筛查 |
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