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skkyy88888

铜虫 (著名写手)

[交流] 原核表达的条带问题

大家好,我最近做了个关于原核表达的实验,经过SDS-PAGE分析,表达出来的条带并不是单一的条带,而是弥散到整个电泳条带中,而未经诱导的大肠杆菌条带却比较专一,请问这是什么原因呢?怎么改进?或者我的条带就根本没表达出来呢?
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)

我想知道诱导跟温度以及摇菌速度有没有关系.我的胶应该是没问题
3楼2008-04-06 22:44:12
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tody4617

木虫 (小有名气)

一根筋家族之独根草

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
我也在做BL21原核表达
1你说未诱导条带清晰,是足够清晰还是大概看的清楚?如果是后者,那么染色长一些,4-5小时,脱色一晚上,如果是前者,看看是不是你做胶有问题,蛋白可以从空的四周扩散出去,造成弥散.
2有一种情况,是你根本没诱导出来,我第一次做的时候,就用的别人的菌,怎么也出不来,后来人家告我说保错菌了,郁闷!
3还有种可能,你诱导的蛋白分子量太大,胶没办法分离开,进而导致一片.
票子-房子-车子-婆子-儿子
2楼2008-04-06 20:15:33
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greenspringmi

银虫 (正式写手)

第一:看转化了目的片断的表达菌株是否表达了,要依据表达载体是否需要加入诱导物质;
第二:在37度,200转左右,三个小时即可(菌株表达了目的蛋白,再从温度等因素来摸索条件,以得到可溶蛋白)
第三:电泳缓冲液要用新的(新配制,不超过2个月;新稀释的),我跑过像你说的那种胶,发现试电泳缓冲液的原因
祝你成功哦!
6楼2008-04-07 09:07:34
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