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ebaiao123

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专业: 植物遗传学

[交流] 水稻-利用高通量测序技术使用多重目的片段富集的方法

利用高通量测序技术使用多重目的片段富集的方法-----水稻检测稀有突变体

一、服务简介：
本服务是一种高效、经济、准确的检测水稻稀有突变的服务，所采用技术为将多重半巢式PCR的富集方法和第二代测序技术的建库过程相结合，在尽可能少PCR扩增的循环数、降低人为引入的点突变的数量的基础上，高效、特异地同时富集多个目标片段。本服务内容包含对模拟混合池中真实突变频率的样本进行建库和富集，然后进行Illumina测序。本方法得到的第二代数据中的测序错误频率显著降低，能够区分真实突变与测序错误。
我们建立了6144份水稻中花11 M2 DNA叠氮化纳突变体群体。利用本技术用36个目标片段（250bp/片段），已筛选了4个8×8×8的三维混合样品池（2048个群体），经过我们一套完整的数据分析，最后获得了33个突变体，
与同类研究相比，PCR是操作简易、成本低且易于与NGS建库相结合的目标片段富集的方法。例如，毛细管电泳（Capillary electrophoresis,CE）目前正逐步取代Li-cor，成为主要的对TILLING群体进行突变体检测的方法。
此技术是由TILLING（Target Induced Local Lesions IN Genomes）技术上研究的基于二代测序的方法，所以本技术也是一种典型的反向遗传学技术，与同类的反向遗传学技术（RNAi, T-DNA，基因敲除，CRISPR等）相比具有一定的优势：1、具有高通量，2、不用转基因，3、突变体的后代遗传稳定等优势。
二、技术优势：
(一) 本技术与毛细管电泳技术相比有一定的优势：
1. 减少对目标片段进行富集的PCR循环数；
2. 有利于多个引物在同一反应体系中的均匀扩增；
3. 避免对内含子区域的富集，使富集区域的设计更为灵活；
4. 适于结合高准确率的建库方法，有较大的发展空间。
(二) 在数据分析方面的优势：
1. 在进行统计推断前去除大部分噪音数据，提高数据中真实突变的数据的比例，进而降低检测的错误率；
2. 过程简单，计算量小；
3. 准确性高。
三、技术路线

四、信息分析
1. 原始数据整理、过滤
2. G-A和C-T SNP的分析
3. 摘除序列及坐标位置，确定目标片段的突变体
五、结果展示

六、送样要求
需要完整的基因组的序列或目标片段的序列，并指出基因的结构。明确标明序列中感兴趣的区域。
七、适用领域
1、对诱变群体中的稀有突变体的筛选
2、在大群体中对目标位点的基因型的检测，用以验证GWAS或外显子组测序的结果
3、在人类群体样本中检测人类疾病的遗传位点

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