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lybio

金虫 (正式写手)

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专业: 生物化工与食品化工

[交流] 请教基因组提取的若干个问题

这个月我做了4次用液氮研磨米曲霉提取基因组DNA，采用SDS-TE 60℃水浴30min（反复颠倒混匀数次），饱和酚：氯仿（1：1）抽提一次（要提前2h配制），饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提两次，2倍冷无水乙醇沉淀20min（请问无水乙醇跟抽提的上清夜是否会均匀混合，感觉加了无水乙醇，处于分层状态，此现象是否正常？加完后没见有絮状白色沉淀出现，但20min后离心有白色沉淀），后用1ml，70％乙醇重漩沉淀，（沉淀很结实，必须用枪头搅，白色沉淀才能分散开，觉得不像是DNA），50℃烘箱干燥后，用加了RNAse 的TE 20ul溶解，37℃放置20min。跑电泳后，居然只有条很小KB的条带，不见基因组DNA。前两个月提过一次，成功了。这月不知为啥怎么提，都提不成，请大家帮忙找下原因，谢谢！

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1楼 2008-04-06 10:20:53

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AFM

木虫 (正式写手)

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专业: 有机高分子功能材料

请搂住参考以下两种方法：
（一）SDS法
（1）接种4℃保存的菌丝予50mL培养基中，28℃ 150rpm,3天，过滤收集菌丝，无菌水洗二次。
（2）向菌丝中加入液氮，迅速研磨至粉末状，取0.5g 左右于1.5mL EP管中，加入500μL 65℃预热的提取缓冲液，于65℃水浴1h，不时混匀。
（3）取出冷却至室温后，4000rpm/min离心5’，将上清移至新的EP管中。
（4）加入等体积的Tris饱和酚抽提，8000rpm/min离心5’，取出水相于新的EP管中。
（5）重复2-3次，直到水相和有机相交界无蛋白层。
（6）取出上清，加入等体积的酚：氯仿混合液抽提，颠倒混匀，8000rpm/min离心5’，取出水相于新的EP管中。
（7）加入等体积氯仿抽提，操作同上。
（8）加入1/10体积的7.5mol/L乙酸铵，轻微混匀。
（9）加入两倍体积的冰冷95%无水乙醇于-20℃沉淀DNA 30’或过夜，10000rpm/min离心10’。
（10）倾上清，用70%冰冷乙醇洗涤沉淀，倒置，使液体流尽，室温或37℃挥干。
（11）用20μl TE（pH 8.0）重悬沉淀，-20℃保存。
（12）1%琼脂糖凝胶电泳检测结果
（二） CTAB法
（1）向CTAB抽提液中加入终浓度为2%的2-巯基乙醇（v/v），于65℃水浴中温浴。同时将CTAB /NaCl溶液放入65℃水浴中加热。
（2）收集菌丝，用液氮研磨，取约0.5g放入EP管中。
（3）向EP管中加入2-ME/CTAB抽提液，于65℃水浴中加热10-60’，不时混匀。
（4）4000rpm离心5’，将上清转移到新的EP管中。
（5）向上清中加入1/10体积的65℃ CTAB /NaCl溶液，颠倒混匀。
（6）加入等体积的氯仿/辛醇抽提，混匀，8000rpm离心5’，转移上清至新的EP管。
（7）加入等体积的CTAB沉淀液，颠倒混匀，若有沉淀，则8），若无，则65℃ 水浴30min。
（8）4℃ 2700rpm离心5’。
（9）移出上清，勿丢弃。高盐TE重悬沉淀（每克加入0.5-1mL）。若难以重悬，则65℃水浴30’，直至沉淀大部分溶解。
（10）加入0.6倍体积异丙醇沉淀核酸。4℃7500rpm离心 10-15min。
（11）用80%乙醇洗涤，用尽可能少的TE重悬沉淀（每克加0.1-0.5mL TE）
用到的主要溶液：
DNA抽提缓冲液：50 mM Tris•Cl (pH 8.0),50 mM EDTA (pH 8.0),3% SDS,1% BME (用前加即 5μl),0.1 mg /mL Proteinase K (用前加,即 10 mg /mL Proteinase K 2.5μl)。
CTAB抽提液：
2%（w/v）CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)
120mmoL/L Tris•Cl pH 8.0
20 mmoL/L EDTA pH 8.0
1.4M NaCl
室温保存
CTAB /NaCl溶液：10% CTAB,0.7M NaCl
CTAB沉淀液：
1%（w/v）CTAB
50mM Tris•Cl pH 8.0
10mM EDTA pH 8.0
愿楼主实验顺利！