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zhouyj木虫 (正式写手)
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[交流]
求助:关于BL21-codon plus(DE3) RIL
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请问应如何制备BL21-codon plus(DE3) RIL感受态细胞,以及应如何转化即在转化中应注意些什么?谢谢! 我们做了两次感受态细胞,按CaCL2方法制备的,转化也是按常规方法在42度热击90秒,可都不长,不知是什么原因!难道是操作过程中有要特别注意的地方吗? |
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2楼2008-04-06 09:40:46
3楼2008-04-06 09:59:53
zhouyj
木虫 (正式写手)
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菌株应该不会有什么问题,我们在含有氯霉素的平板上划过线,长得挺好的,在制备感受态过程中也加入了 氯霉素. 详细的制备过程如下: 1.在5ml LB(含20 ug/ml 氯霉素)液体培养基中接菌,过夜培养. 2.第二天按1:100体积接菌于100 ml LB液体培养基中(含氯霉素),培养0D至0.3-0.4. 3.在7ml离心管中分装5ml菌液,至冰上30分钟. 4.4100rpm离心4度5分钟,把上清吸净,再加入3ml 0.1mol/L CaCl2,至冰上10分钟.4100rpm离心4度10分钟. 5.弃上清,再重复第4步. 6.弃上清,每管加入150ul氯化钙,最后加甘油,至冰上30分钟后分装,置于-70度冰箱. 转化的步骤如下: 1.在100ul感受态细胞中加入质粒,置冰上30分钟. 2.42度热击90s,置冰上2分钟后加入400 ul LB培养基(不含氯霉素) 3.110rpm复苏50分钟. 4.涂板,平板上有氯霉素和卡那霉素. 希望达人们指导下看下具体哪一步有问题. [ Last edited by zhouyj on 2008-4-6 at 10:40 ] |
4楼2008-04-06 10:34:05
5楼2008-04-06 11:48:30
6楼2008-04-07 08:05:23
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做感受态有几点要特别注意： 第一：种子用你所能找到的最好的，一般来说用商业的感受态作为种子是上上选择啦 尽量不要用传了几次的感受态作种子 第二：制作感受态过程中：低温、无菌！ 第三：感受态制备好后，放置在4度过夜再用转化效率最高；但是在24小时内不用的要立即用液氮冻起放在-70或者-80中保存 第四：检测感受态的转化效率是需要四块板：一块不加抗生素的LB板；三块加抗生素的LB板。 转化时要做三个转化：1、转化体系中包括10uL水和100ul感受态--涂在不加抗生素的板上 2、转化体系中包括10uL水和100ul感受态--涂在加抗生素的板上 3、转化体系中包括10uL环状空载体和100ul感受态---涂在加抗生素的板上 4、转化体系中包括10uL连接成功的含插入片断的载体和100ul感受态---涂在加抗生素的板上 如此检测，除了第二个板其他三块板都应该有菌生长，转化效率也可以大概判断了 |
7楼2008-04-07 09:34:43
